User:Volker Gatterdam/Protokolle/Proteinaufreinigung
From OpenWetWare
Jump to navigationJump to search
Proteinaufreinigung
French Press
3 x pressen
- zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20min
- dekantieren zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20 min
Ni-NTA
Ni-NTA 0,75 ml/min (max 1,5) 0,1 cm/min
Vorbereitung
Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min 10 min H2O 10 min 100% HEPES B 10 min 3% HEPES B
Probe
Flussgeschwindigkeit: 0,75 mL/min Papiervorschub: 0,1 cm/min
- Probe auf Ni-NTA Säule auftragen
- Mit 3% HEPES B spülen bis unspezifische Proteine entfernt sind.
- Anschließend mit Gradienten eluieren
Reinigen
Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min 20 min 100% HEPES B 20 min H2O 10 min 20% EtOH
Analytik
Bradfordtest
10µL Probe 100µL Bradford
SDS-Gel
12µL Probe 4µL 4xSDS Probenpuffer 13.000 rpm 3min 95°C für 5 min
7,5% Gel 300 V 40 mA ~1 h
Hi-Trap
GeFi-Puffer
2 ml/min 1,5 mL Probe pro Säule
TECHNICAL SPECIFICATIONS HiTrap™ Desalting Column
Column volume | 5 ml |
Sample volume | 0.25-1.5 ml |
Elution volume | 1.0-2.0 ml |
Max. flow rate (H2O at 25°C) | 15 ml/min |
Recommended flow rate | 1-10 ml/min |
Max. pressure | 3 bar (43 psi, 0.3 MPa) |
Chemical stability | Stable in all commonly used buffer systems |
pH stability | 2-13 (long and short term) |
Storage | 20% ethanol |
Storage temperature | 4°C to 30°C |
Gelfiltration
Säulenvolumen 320 mL
Reinigen
Flussgeschwindigkeit: 2 mL/min 1/2-1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH (200 mL) 1-2 Säulenvolumen H2O 1-2 Säulenvolumen 20% EtOH