User:Volker Gatterdam/Protokolle/Proteinaufreinigung

Proteinaufreinigung

French Press

3 x pressen

• zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20min
• dekantieren zentrifugieren 17.000 rpm 4°C 20 min

Ni-NTA

Ni-NTA 0,75 ml/min (max 1,5) 0,1 cm/min

Vorbereitung

Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min
10 min H2O
10 min 100% HEPES B
10 min 3% HEPES B

Probe

Flussgeschwindigkeit: 0,75 mL/min
Papiervorschub: 0,1 cm/min

• Probe auf Ni-NTA Säule auftragen
• Mit 3% HEPES B spülen bis unspezifische Proteine entfernt sind.
• Anschließend mit Gradienten eluieren

Reinigen

Flussgeschwindigkeit: 1,5 mL/min
20 min 100% HEPES B
20 min H2O
10 min 20% EtOH

Analytik

Bradfordtest

10µL Probe
100µL Bradford

SDS-Gel

12µL Probe
4µL 4xSDS Probenpuffer
13.000 rpm 3min
95°C für 5 min

7,5% Gel 300 V 40 mA ~1 h

Hi-Trap

GeFi-Puffer

2 ml/min 1,5 mL Probe pro Säule

TECHNICAL SPECIFICATIONS HiTrap™ Desalting Column

Column volume	5 ml
Sample volume	0.25-1.5 ml
Elution volume	1.0-2.0 ml
Max. flow rate (H2O at 25°C)	15 ml/min
Recommended flow rate	1-10 ml/min
Max. pressure	3 bar (43 psi, 0.3 MPa)
Chemical stability	Stable in all commonly used buffer systems
pH stability	2-13 (long and short term)
Storage	20% ethanol
Storage temperature	4°C to 30°C

• HiTrap™

Gelfiltration

Säulenvolumen 320 mL

Reinigen

Flussgeschwindigkeit: 2 mL/min
1/2-1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH (200 mL)
1-2 Säulenvolumen H2O
1-2 Säulenvolumen 20% EtOH