User:Volker Gatterdam/Protokolle/Expression

Expression von TycA & GrsA (M15 pQE60 pREP4)

• LB-Medium autoklavieren und über Nacht bei 250 rpm und 37°C schütteln zum Sauerstoff anreichern und vorwärmen.

2 L Kolben mit je 0,5 L Medium
5 L Kolben mit je 1,25 L Medium

Zellwachstum

• Antibiotika hinzugeben

bei 0,5 L
1000 µL amp 50K --> amp 100 (100 µg/mL)
250 µL kan 50K --> kan 25 (25 µg/mL)

bei 1,25 L
625 µL kan 50K --> kan 25 (25 µg/mL)

• 1:100 Übernachtzellkultur hinzugeben
• Zellen bei 250 rpm und 37°C bis zu OD600 = 0,3-0,4 wachsen lassen dann Temperatur schon auf 30°C langsam erniedrigen.

Induktion

• Ab OD₆₀₀ = 0,6 Temperatur auf 25°C erniedrigen und Induktion mit 100-300 µL IPTG (0,1-0,3 mM)
• 4 Stunden expremieren (Alternativ über Nacht bei 18°C mit 0,1 mM IPTG)
• Zellen runter fugen (6000 rpm für 20 min)
• etwa in 20 mL 3% HEPES B resuspendieren und wegfrieren (-20°C)

Analytik

SDS-PAGE

• 1 mL Zellsuspension zentrifugieren und Pellet lösen in
• 75 µL TE-Puffer
• 25µL 4xSDS Puffer

10 min bei 95°C aufkochen und anschließend bei 13.000 rpm für 3 min zentrifugieren. Es werden 15 µL des Überstandes pro PAGE-Tasche aufgetragen. Einstellungen für das Netzteil sind 10 mA und 300V.

Quellen

• Protein Expression and Purification (OpenWetWare)