User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/05/11

Project name

Main project page Previous entry

Clonagem molecular 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. Ser Humano: 2 x 1013 cópias do gene 1 Ltr de uma cultura de bactérias: 700 x 5x109 x 1000 = 3.5 x1015cópias do gene, ou seja, ~100 x mais cópias 2. Considere os vectores apresentados: 2.1. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique. O vector B, porque para produzir a proteína é necessário trasncrever o gene que a codifica, o que só é possível quando este se encontra associado a um promotor. Apenas o vector B tem promotor antes do local de policlonagem. 2.2. Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem: Escolheria o fragmento BamHI-EcoRI. Estas enzimas de restrição também se encontram no local de policlonagem do vector, na orientação desejada em relação ao promotor. Sendo as extremidades geradas pelo seu corte incompatíveis entre si, a ligação deste fragmento com um vector tratado com as mesmas enzimas só pode originar o vector recombinante desejado. Pelo contrário, se efectuar a clonagem com o fragmento EcoRI-EcoRI, podem suceder várias ligações indesejadas: o vector pode fechar sobre si próprio e o fragmento pode ligar-se de forma invertida. 3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? Digerindo vector e gene com a enzima BamHI e em seguida fazendo uma reacção de ligação. O produto da reacção de ligação será utilizado para transformar uma população de bactérias, que será depois seleccionada numa cultura em meio sólido na presença de ampicilina. Apenas as bactérias que tiverem incorporado o plasmídeo sobreviverão e a sua multiplicação vai resultar na formação de colónias (clones genéticos) visíveis a olho nú. Dada a baixa eficiência do processo de transformação, cada colónia vai conter apenas a cópia de um único plasmídeo original. Esta é a única escolha possível de enzimas que permite incluir toda a região codificante do gene. No entanto, não garante que os produtos da reacção de ligação correspondam à contrução desejada: poderão formar-se com probabilidade semelhante plasmídeos recircularizados, plasmídeos com o gene invertido e plasmídeos com o gene na orientação correcta, tendo em vista a sua expressão. 3.2 Como procederia para resolver o problema? Iria testar várias colónias resultantes da transformação da reacção de ligação à procura daquela que contém o vector recombinante de interesse. Os três tipos de vectores que podem estar presentes nas bactérias são facilmente distinguidos pelo padrão de restrição obtido após digestão com as enzimas KpnI e EcoRI: Vector vazio - 1 fragmento de 4,7Kpb Vector recombinante correcto - 2 fragmentos de aproximadamente 0,8Kbp e 4,8Kpb Vector recombinante invertido - 2 fragmentos de aproximadamente 0,13Kbp e 5,5Kpb Para isolar uma população de bactérias contendo o vector de interesse deveria então proceder da seguinte forma: 1. Inocular várias colónias resistentes em culturas líquidas independentes (p. ex. 10) na presença de antibiótico e deixar crescer; 2. Retirar uma parte de cada cultura e purificar o plasmídeo presente nas bactérias pelo método de lise alcalina descrito na introdução; 3. Submeter o DNA purificado a uma digestão com as enzimas de restrição EcoRI e KpnI; 4. Analisar os produtos da reacção de digestão por electroforese em gel de agarose. 5. Escolher a cultura de onde foi isolado o DNA de interesse para o amplificar e purificar em grande escala. 3.3 Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? A digestão do palsmídeo isolado com EcoRI produziu uma banda com cerca de 5Kbp, e a digestão dupla com EcoRI e KpnI produziu dois fragmentos com cerca de 800bp e 4.5Kbp. Tendo em conta as previsões efectuadas na alínea anterior, posso concluir que a clonagem funcionou.