User:Margarida Azevedo/Notebook/Margarida Azevedo/2010/03/23
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Que características deve ter um primer de PCR? Tem de ter aproximadamente 20 nucleótidos e tem que ser complementar ao ínicio da sequência que queremos amplificar. Primer 5'-3' e primer 3'-5'. Tem extremidade 3' OH livre para a DNA polimerase poder iniciar sintese. Primers não devem ser complementares entre si (risco de ligação) e a temperatura óptima de actuação entre 50-60ºC.
O processo de RT-PCR pode separar-se dois passos: o primeiro consiste na passagem de RNA mensageiro para cDNA e o segundo em amplificar o cDNA. No primeiro passo, o primer ideal é oligo-dT (conseguem ligar-se à sequência 3'polyA localizada na região 3' UTR que está presente na maioria dos mRNAs), quando apenas queremos focar-nos em mRNA's. Quando não pretendemos estudar uma região especifica/gene utilizamos random primer (o que diminui a optimização do processo e resulta na transcrição reversa tanto de mRNAs como de RNAs não codificantes). o primer de gene especifico, permite-nos obter um cDNA especifico que ja sabemos querer estudar dum mRNA único.
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Fazer RT-PCR da sequência,usando primer de gene específico, e comparar a sequência de DNA complementar com o gene da globina (DNA)no BLAST. Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Fazer PCR da sequência do gene da beta-blobina da Mariae dos pais e comparar com as sequências na base de dados. A partir de mRNA's da beta-globina dos pais e da Maria, fazer a tradução da sequência de forma a verificar se a proteína é afectada | |
