TP4
PCR e RT-PCR
[edit] Questões
Que características deve ter um primer de PCR?
Um primer corresponde a um fragemnto de DNA de 15-30 nucleotidos com um conteudo elevado em GC(40-60%). Numa reacção de PCR existem dois primers(Forward e Reverse) ligados à terminação 3' complementar a cada uma das cadeia simples de DNA, os 5 últimas nucleótidos ligadas a este terminal devem ser G ou C para aumentar a estabilidade. A ligação dos primers À cadeia ocorre a temperaturas entre 50 e 65ºC. Um primer tem de ser uma estrutura linear(sem hairpins ou qualquer outra estrutura secundária)e as repetições de nucleótidos devem ser evitadas.
Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?
O primer específico de gene deve ser utilizado quando pretendemos obter fragmentos de DNA específicos do gene que está a ser estudado. Por exemplo, no caso de uma mutação génica este método facilmente nos permite identificar essa alteração nos genes. Este método contudo não é muito adequado quando pretendemos sequenciar diferentes fragmentos de DNA em simultâneo.
O primer oligo-dT é util quando se pretende obter cDNA por uma única reacção de RT PCR pois vai haver transcrição de fragmentos de mRNA com cauda de poli-A. Estes primers não são adequados quando se quer obter fragmentos de DNA de outras regiões sem esta terminação ou quando as sequências são demasiado longas a amplificação pode ser incompleta.
O primer Random tem a vantagem de poder ser utilizado para transcrever diferentes regiões(codificantes e não codificantes) e tipos de RNA uma vez que são utilizados diferentes primers permitindo-nos sequenciar a região terminal da cadeia que pela utilização de um unico primer seria dificil. Possui como desvantagem o facto de não ser específico para quando queremos transcrever sequências específicas e o facto de transcrever demasiados fragmentos de RNA, a maioria inespecíficos e de dimensões variáveis.
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
Para identificar uma mutação no DNA recorreria à técnica de PCR. Inicialmente, é feita uma pesquisa por forma a encontrar os primers adequados, seguidamente o DNA é amplificado e por fim ocorre a sequenciação. Este procedimento deve ser aplicado tanto aos pais como à própria Maria para que sejam identificadas (após comparação)as mutações.
Para estudar a expressão do gene partindo do mRNA de cada individuo, é possivel obter cDNA pela acção da transcriptase reversa (RT-PCR).O cDNA é analisado posteriormente quanto ao tamanho e composição da sequência sendo então por fim comparada com sequências sem mutação.
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