User:Gaston Paris:Notebook/Vectores pK19mobSacB

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Idea General

Clonar en pK19mobSacB los fragmentos flanqueantes de los siguiente genes:

  • LOV-HK de Brucella
  • BAB1_1671 de Brucella

Clonar en el vector pSac las regiones flanqueantes de los siguientes genes:

  • RR2 de Rhizobium
  • RR5 de Rhizobium

En este caso se clonaran con los genes de resistencia Km y Spectinomicina.

Chequeo

Δ1671 esta Ok. Los oligos corresponden a lo esperado. Se espera un fragmento de 325 pb para la región 5' y 329 pb para la región 3'.

PCR para amplificar fragmentos (20/11/09)

X1 MIX X4.5
Primer FWD 10 μM 5μL - μL
Primer REV 10 μM 5μL - μL
gDNA Brucella 100 ng/μl 1μL 4.5μL
10X Buffer pfu 7.5μL 33.75μL
dNTPS 2 mM 5μL 22.5μL
pfu FIL 1μL - μL
H2O 25.5μL 114.75 μL

A cada tubo se agregaron 5 μL de primer FWD y 5 μL de primer REV, 39 μL de MIX y 1 μL de Pfu FIL. Se largo en PCR IVEMA (Lab302) con los siguientes ciclos:

  • 5' a 94°C
  • Seguido de 35 ciclos de:
    • 30" a 93°C
    • 1' a 55°C
    • 1' a 68°C
  • 10' a 72°C de extensión final

Los tubos se rotularon: