Objetivo

Construir las cepas mutantes de CheY, BAB1_0100 en B. abortus 2308 y clonar los genes correspondientes en pTrcHis. Evaluar la infección en macrófagos en condiciones de luz y oscuridad.

Estrategia

Mutantes

Se amplificaran las regiones 5' y 3' de cada gen para luego purificarlas y realizar una PCR recombinante con los fragmentos. El fragmento recombinante se digerirá y purificará por gel para luego clonarlo en el vector pK18mobSacB.

Se utilizarán los siguientes oligos:

5CheyFWD-BamHI y 5CheyREV fragmento 5' de CheY

3CheyFWD y 3CheyREV-SalI fragmento 3' de CheY

5Ba_0100FWD-BamHI y 5BAB_0100REV fragmento 5' de BAB1_0100

3BAB_0100FWD y 3BAB_0100REV-SalI fragmento 3' de BAB1_0100

La presencia del inserto correcto se verificará por colony PCR y digestión.

Los clones adecuados se transformaran en E.coli S-17 para luego movilizarlos a Brucella abortus 2308 por conjugación. Los clones simple recombinantes se seleccionaran por resistencia a Kanamicina, Ampicilina y ácido nalidíxico.

Los dobles recombinantes se seleccionaran por crecimiento en presencia de sacarosa.

El knock-out se confirmará por colony PCR y secuencia

Clonado Proteínas

Se amplificaran los genes CheY de B. abortus (BAB1_0099) y el regulador transcripcional río arriba de él (BAB1_0100). Los fragmentos amplificados se digeriran y purificaran por gel de agarosa para luego ligarlos al vector pTrcHisB (Invitrogen)

Se utilizaran los siguientes oligos:

CheY_FWD_Nhe y BAB1_0099_reverse para el gen CheY.

BAB_0100FWD_Nhe y BAB_0100REV_XhoI para el regulador transcripcional.

Resultados

Martes 30/10/07

Transformé 80 μl de DH5α con 2 μl de pK18mobSacB que me enviaron de Japón. Luego de recuperar en SOC, se inocularon 25 ml de SOB, que se pusieron a crecer a 37°C O.N.

Miércoles 31/10/07

Calle 1: Marcador λHindII, calles 2 y 3: 1 μl de minipreparaciones 1 y 2, respectivamente; calles 4 y 5: 3 μl de mipreparaciones 1 y 2, respectivamante.

Se cosecharon 6 ml de cultivo de pK18monSacB por duplicado y se realizaron minipreps con el kit Qiagen utilizando el doble de volumen indicado en el protocolo estándar. Se corrieron alícuotas en un gel de agarosa para confirmar la cantidad y calidad. Se guardan a -20°C.

Jueves 1/11/07

Llegaron los oligos. Los diluyo a 10 μM y preparo el protocolo para amplificar.

Viernes 2/11/07

Prepare reacciones de PCR de acuerdo a la siguiente receta.

Primer FWD	5 μl
Primer REV	5 μl
gDNA Brucella 100 ng/μl	1 μl
10X Buffer pfu	7,5 μl
dNTPS 2 mM	5 μl
pfu FIL	1 μl
H2O	25,5 μl

Calle 1:MWM Movil19, luego siguen en orden la PCRs 1 a 6 (ver referencia)‎

A cada tubo se agregaron los oligos y luego 33,7 μl de la siguiente mix:

gDNA Brucella 100 ng/μl	6,5 μl
10X Buffer pfu	48,75 μl
dNTPS 2 mM	32,5 μl
pfu FIL	1 μl por tubo
H2O	165,75 μl

Las condiciones de ciclado en la PCR Genius fueron:

5' a 94°C
Hot Start a 80°C (se agregó 1 μl de pfu a cada tubo)
Seguido de 35 ciclos de:
30" a 93°C
1' a 55°C
1' a 68°C
Y 10' a 72°C de extensión final

Lo siguiente es la referencia:

Tubo Nro	Primer FWD	Primer REV
1	5CheyFWD-BamHI	5CheyREV
2	3CheyFWD	3CheyREV-SalI
3	5Ba_0100FWD-BamHI	5BAB_0100REV
4	3BAB_0100FWD	3BAB_0100REV-SalI
5	CheY_FWD_Nhe	BAB1_0099_reverse
6	BAB_0100FWD_Nhe	BAB_0100REV_XhoI

Lunes 5/11/07

Se corrió un gel con 20 μl de cada PCR 1 a 6 y se cortaron las bandas correspondientes

Martes 6/11/07

Las bandas cortadas ayer se purificaron por Illustra GFX PCR (GE). Se guardan congeladas hasta mañana.

Miércoles 7/11/07

Calle 1: PCR1 2-11-07, calle 2: PCR2 2-11-07, calle 3: PCR3 2-11-07, calle 4: PCR4 2-11-07. Calles 5 a 7: fragmentos de colony PCR del segundo screening de la library

Corrí un gel con 5 μl de cada purificación.

Jueves 08/11/07

PCR recombinante de armado de la estrategia de deleción de CheY y BAB1_0100.

CheY		BAB1_0100
5 CheYFWD BamHI	5 μl	5 Ba_0100FW BamHI	5 μl
3 CheYREV SalI	5 μl	3 BAB_0100REV SalI	5 μl
Frag PCR1	10 μl	Frag PCR3	10 μl
Frag PCR2	10 μl	Frag PCR4	10 μl
10X Buffer Pfu	15 μl	10X Buffer Pfu	15 μl
dNTPs 2mM	10 μl	dNTPs 2mM	10 μl
pfu FIL	1 μl	pfu FIL	1 μl
H20	44 μl	H20	44 μl

Las condiciones de la PCR genius fueron las siguientes:

5' a 94°C
Hot Start a 80°C (se agregó 1 μl de pfu a cada tubo)
Seguido de 35 ciclos de:
30" a 93°C
1' a 55°C
2' a 68°C
y 10' a 72°C de extensión final

Las PCR 5 y 6 del 7/11/07 se extrajeron una vez con cloroformo y se precipitaron con 0,7 volumenes de isopropanol y 0,3M de acetato de sodio.

Viernes 09/11/07

Calle 1: PCR recombinante CheY, calle 2: PCR recombinante BAB1_0100, MWM: 1kb ladder + movil 19

Corrí un gel con 10 μl de la PCR recombinante. Aparecen las bandas esperadas de 1 Kb.

Extraigo una vez con cloroformo y precipito con isopropanol + 0,3 M acetato de sodio.

Digestiones de los fragmentos precipitados:

Para clonar los genes Chey y BAB_0100 con NheI-XhoI, junto con el vector pTrcHisB
Para clonar los fragmentos recombinantes con BamHI-SalI, junto con el vector pK18mobSacB

	CheY Recombinante	BAB_0100 Recombinante	pK18mobSacB
H20	18 μl	18 μl	DNA miniprep 18 μl
NEBuffer 3 10X	2,5 μl	2,5 μ	2,5 μ
BSA 10X	2,5 μl	2,5 μl	2,5 μl
BamHI	1 μl	1 μl	1 μl
SalI (NEB)	1 μl	1 μl	1 μl
Volumen final	25 μl	25 μl	25 μl

	Gen CheY	Gen BAB_0100	pTrcHisB
H20	18 μl	18 μl	DNA QIAGEN 18 μl
NEBuffer 2 10X	2,5 μl	2,5 μ	2,5 μ
BSA 10X	2,5 μl	2,5 μl	2,5 μl
NheI (NEB)	1 μl	1 μl	1 μl
XhoI (NEB)	1 μl	1 μl	1 μl
Volumen final	25 μl	25 μl	25 μl

Se incubó a 37°C 2-3hs. Luego se congelaron.

Lunes 12/11/07

Corrí un gel con las digestiones del viernes y las PCR de CheY y BAB1_0100.

Corté las bandas y las purifiqué por Qiaquick.

Martes 13/11/07

Calles 1 y 8: MWM λ HindIII. Calle 2: pK18mob SacB Bam-Sal. Calle 3: recombinante ΔCheY Bam-Sal. Calle 4: recombinante ΔBAB_0100 Bam-Sal. Calle 5: pTHB Nhe-Xho. Calles 6 y 7: PCRs CheY y BAB_0100 que se cayeron del gel

Corrí 3 μl de cada purificación en un gel de agarosa. Cuantificación:

pK18mobSacB 20 ng/μL
ΔCheY 10 ng/μL
ΔBAB_0100 80 ng/μL
pTHB 50 ng/μL
CheY y BAB_0100 considero 10 ng/μL porque se fueron del gel.

Ligación

	Control -	ΔCheY	ΔBAB_0100
pK18mobSacB	1 μL	1 μL	1 μL
ΔChey	-	1 μL	-
ΔBAB_0100	-	-	1 μL
Buffer ligasa 10X	1 μL	1 μL	1 μL
Ligasa 1/10	1 μL	1 μL	1 μL
H₂O	7 μL	6 μL	6 μL

	Control -	CheY	BAB_0100
pTHB	0,5 μL	0,5 μL	0,5 μL
Chey	-	1 μL	-
BAB_0100	-	-	1 μL
Buffer ligasa 10X	1 μL	1 μL	1 μL
Ligasa 1/10	1 μL	1 μL	1 μL
H₂O	7 μL	6 μL	6 μL

Las ligaciones las guardé congeladas hasta que regreso de SAIB

Miércoles 27/11/07

Transformé 50 μL de células DH5α electrocompetentes con 5 μL de cada ligación. La recuperé con 1 mL de SOC y plaquee 200 μL en placas de LB ampicilina 100 ng/mL y kamicina 25 ng/mL.

Jueves 28/11/07

Las placas parecen estar correctas. El clonado en pTrcHisB funcionó correctamente y en pK18mobSacB está en el mismo nivel que el control

Placas de la ligación en pK18mobSacB de los insertos recombinantes ΔCheY y ΔBAB_0100. La de abajo corresponde al control sin inserto

Placas de la ligación en pTrcHisB de los insertos CheY y BAB_0100. La de abajo corresponde al control sin inserto

Lunes 03/12/07

MWM en ambas filas: Movil 1kb en calles 1 y Movil 19 en calles 13. Fila superior, pTHB: calles 2 a 6, CheY y calles 7 a 11, BAB_0100. Fila inferior, pK18mobSacB: calles 2 a 6, ΔCheY y calles 7 a 11, ΔBAB_0100

Corrí una colony PCR tomando 5 colonias de las placas de la ligación.

MIX

	X1	X7
Primer FWD	1 μL	7 μL
Primer REV	1 μL	7 μL
10X Buffer Taq	2 μL	14 μL
Cl₂Mg 50 mM	0,6 μL	4,2 μL
dNTPS 2 mM	2 μL	14 μL
Taq FIL	1 μL	7 μL
H2O	12,4 μL	86,8 μL

Se agregaron 20 μL a cada tubo en el cual se adicionó una colonia con un tip. El tipo se introdujo en 2 mL de LB con 100 ng/mL de ampicilina o 25 ng/mL de kanamicina y se incubó a 37°C

Las condiciones de la PCR genius fueron las siguientes:

5' a 94°C
Seguido de 35 ciclos de:
30" a 93°C
30" a 55°C
45" a 72°C
y 10' a 72°C de extensión final

Viernes 14/12/07

Comprobé las presencia de insertos en minipreps de los clones positivos. Solamente los clones en pTrcHisB con positivos y no los pK18mobSacB. Renombro los plásmidos: pTrcHisB-CheY a pGP0100 y pTrcHisB-BAB1_0100 a pGP0101.

Lunes 17/12/07

Retomo el clonado en pK18mobSacB. Voy a rehacer las PCRs recombinantes, posterior digestión y ligación.

Utilizo la enzima Pfx de Invitrogen para repetir la PCR recombinante. Comienzo con los fragmentos amplificados y purificados del 2/11/07 nombrado PCR1, 2, 3 y 4.

Protocolo PCR

Calle 1 a 3: C1 a C3, calles 4 a 6: B1 a B3, calle 7: MWM, λ/HindIII y Movil19

	C1	C2	C3
5CheyFWD-BamHI	1 μL	1 μL	1 μL
3CheyREV-SalI	1 μL	1 μL	1 μL
PCR1	5 μL	5 μL	5 μL
PCR2	5 μL	5 μL	5 μL
10X Amplification Buffer (Invitrogen)	10 μL	10 μL	10 μL
50 mM SO₄Mg	1 μL	1 μL	1 μL
2 mM dNTPs	7,5 μL	7,5 μL	7,5 μL
10X PCR Enhancer Solution (Invitrogen)	-	5 μL	10 μL
Pfx polymerase (Invitrogen)	0,5 μL	0,5 μL	0,5 μL
H₂O	19 μL	14 μL	9 μL

	B1	B2	B3
5Ba_0100FWD-BamHI	1 μL	1 μL	1 μL
3BAB_0100REV-SalI	1 μL	1 μL	1 μL
PCR3	5 μL	5 μL	5 μL
PCR4	5 μL	5 μL	5 μL
10X Amplification Buffer (Invitrogen)	10 μL	10 μL	10 μL
50 mM SO₄Mg	1 μL	1 μL	1 μL
2 mM dNTPs	7,5 μL	7,5 μL	7,5 μL
10X PCR Enhancer Solution (Invitrogen)	-	5 μL	10 μL
Pfx polymerase (Invitrogen)	0,5 μL	0,5 μL	0,5 μL
H₂O	19 μL	14 μL	9 μL

Las condiciones en la PCR Genius fueron las siguientes:

5' a 94°C
Hot Start a 80°C

35 ciclos de:

30" a 93°C
1' a 55°C
1' a 68°C

seguido de un ciclo:

10' a 68°C

Precipitación

A las reacciones les agregué 150 μL de H₂O y realicé una extracción con cloroformo. Centrifugué 5 min a máxima velocidad y tome la fase superior, a la cual le adicioné 0,1 volúmenes de AcNa 3M y 0,7 volúmenes de Isopropanol. Centrifugué 25 min a máxima velocidad. Lavé el pellet con etanol 70% y deje secar.

Digestión

Repetí las digestiones como el 9/11/07. Incluí dos tubos control con el plásmido pTrcHisB


pTrcHisB (Qiagen)	3 μL	3 μL
NeBuffer 3 10X	2,5 μL	2,5 μL
BSA 10X	2,5 μL	2,5 μL
BamHI	1 μL	-
SalI	-	1 μL
H₂O	17 μL	17 μL

1 h 37°C

Martes 18/12/07

Corro un gel con las digestiones de ayer y purifico las bandas de pK18, ΔCheY y ΔBAB1_0100 por Qiaquick.

User:Gaston Paris:Notebook/Mutantes CheY

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