User:Gabriela Santos/Notebook/GabrielaSantos BIOMOL/2010/05/11
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A utilização de enzimas de restrição e vectores de DNA permite criar moléculas de DNA recombinantes e cloná-las em bactérias.
As bactérias transformadas com uma única molécula de DNA plasmídeo podem ser isoladas em placas de petri graças ao gene de resistência presente no vector., Em seguida, podem ser multiplicadas em culturas líquidas de pequena, média ou grande escala e utilizadas como "fábricas" de DNA, de onde se pode purificar o vector plasmídico, separando-o do DNA genómico e proteínas bacterianas pelo método da lise alcalina.
Consultar página original das imagens O DNA presente em cada colónia bacteriana pode ser analizado por digestão com enzimas de restrição, para confirmar que contém a sequência desejada. O DNA assim purificado pode ser introduzido noutras células (por exemplo, em células humanas) para, por exemplo, expressar a proteína codificada pelo gene clonado.
Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. Um organismo humano contém 10^13 celulas e cada célula contem 2 cópias de um gene, podemos dizer que no total o organismo possui: 2*10^13 copias do gene. Uma bactéria pode ter 700 cópias de um plasmideo o que implica que pode conter 700 copias do gene (isto se os plasmideos forem todos iguais). Em 1L de cultura de baterias teríamos: 5*10^9*1000*700=35*10^14 copias do gene. 2. Considere os seguintes vectores:
2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique. Escolheria o vector B porque é o que contem um promotor, permitindo a iniciaçao do processo de transcrição. 2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades: Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem: Escolhia o fragmento que contem a extremidade BamHI e EcoRI. A escolha de um fragmento com extremidades diferentes apesar se ser mais dispendioso para o laboratório é mais seguro para obter resultados fiaveis. A utilização de duas enzimas de restrição diferentes permite com que depois da abertura do vector com estas enzimas não há o perigo de o vector se fechar sobre si mesmo. alem disso permite que o fragmento ao ser introduzido no vector ocorra na orientação correcta, nao podendo ser colocado ao contrário (visto que as extremidades de ligação sao diferentes.
3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?
Sim, porque se obtiveram 2 fragmentos, um com ~800 pb e outro com ~4500 pb na 3ªcoluna da electroforese, que advêm do corte com as enzimas Eco RI e Kpn I. Assim podemos dizer que não existiram erros na introdução do fragmento no vector e que ele foi colocado na orientação correcta. Retrieved from "http://www.openwetware.org/wiki/BIOMOL_LCS/2010:TP_8" |