User:Gabriela Santos/Notebook/GabrielaSantos BIOMOL/2010/05/04

Project name

Main project page Previous entry      Next entry

Entry title Vectores Os vectores de DNA permitem a replicação, transporte e/ou expressão de segmentos de DNA de interesse para células alvo. Os vectores mais frequentemente utilizados são vectores plasmídicos, moléculas de DNA circulares derivadas de sequências de DNA bacteriano extra-cromossómico e modificadas para incluir elementos genéticos de interesse. 1. Quais as características básicas que um vector plasmídico deve ter? Um vector é uma molécula de DNA que tem várias características de modo a permitir a clonagem de genes. Deve ser capaz de se replicar dentro da célula hospedeira e conseguir produzir numerosas cópias de DNA recombinante, sendo estes capazes de passar para as células filhas. Os vectores plasmídicos devem ser capazes de transportar um ou mais genes que lhe confiram propriedades particulares, tais como a resistência a certos antibióticos. Deve possuir pelo menos uma sequência de DNA que possa actuar como origem de replicação (ORI), de modo a que seja capaz de se multiplicar independentemente dos cromossomas bacterianos. Os plasmídeos mais pequenos aproveitam as enzimas de replicação de DNA da célula hospedeira de modo a fazerem cópias de si próprios, enquanto que alguns dos maiores transportam genes que codificam enzimas especiais e específicas para a replicação dos plasmídeos. Deve possuir um gene de resistência associado a um promotor que permite a selecção das bactérias na presença do antibiótico em causa à resistência (ex: rAMP) e ainda deve conter um local de (poli)clonagem, isto é, um local de reconhecimento onde as enzimas de restrição identificam e cortam o plasmideo permitindo a integração do gene em questão. Se não tiver esse local, o plasmídeo não pode ser aberto para a inserção de novos genes. 2. Os vectores podem ser representados pela sua sequência de DNA ou por mapas que incluem a indicação dos elementos mais relevantes presentes no vector. Pesquise no google imagens dos vectores pUC, pGEX, pcDNA, pEGFP e o sistema pTre/pTet-On. Que diferentes características apresentam estes vectores e para que servem? pUC: é um vector só para clonagem em bactéria muito antigo. Contém a ORI, tem uma resistência para a ampicilina e um local de policlonagem. pGEX: Contém a ORI, utilizado para clonagem em bactérias, contem o gene para a lactose, possui o gene de resistência à Ampicilina(rAMP), tem um local de policlonagem, tem a capacidade de fazer proteínas de fusão, ao juntar o gene com a glutatião transferase (GST) faz com que a separação do produto desejado seja depois muito mais fácil, através da utilização da trombina, utiliza a enzima de restrição a BamHI. pEGFP: Contem a ORI, tem uma resistência kanomicina e a neomicina, permite a clonagem em eucariotas, expressa o gene para a proteína fluorescente (EGFP). A zona de policlonagem esta a montante do gene que expressa a proteina floruescente, e a jusante o sinal de poli adenilação. Tem o promotor do citomegalovirus cMV (citomegalovirus – virus de macaco) e para o SV40 e permite introduzir um promotor que nos interesssa que vai regular a expressar da proteina EGFP. (coloca-se o promotor e introduz-se o vector nas celulas eucariotas e se o promotor for activado vai existir produção de EGFP). pcDNA: Serve para cleulas de eucariota como de bacteria. Tem resistencia a ampicilina e neomicina (consegue ser expresso em células humanas e ser seleccionado com antibióticos específicos). Tem uma grande variedade de enzimas na zona de policlonagem, que permite clonar muitos fragmentos de DNA com extremidades diferentes. Tem um sinal de poliadennilação de BGH. É um vector de expressão para celulas de eucariota, permite expressar proteinas diferentes, sob o controlo de um promotor forte que é o do cMV (citomegalovirus – virus de macaco). sistema pTre/pTet-On: implica que o vector pode não estar a produzir nada e ao se fornecer um estimulo ao plasmidio, ele inicia o seu processo de transcrição e formação de mRNA. 3. De que forma é que um vector plasmídico é mantido na célula alvo? Em eucariotas o vector é mantido na celula por longos periodos tempos se for incorporado no genoma, se não quando a celula se divide ele não é dividido tambem, ficando intacto numa das celulas filhas podendo acabar por ser expelido. Alem disso, o vector também consegue ser mantido na célula, devido à existência de fenómenos de selecção natural como é o facto da expressão de genes de resistência a antibióticos. 4. Para além de vectores de DNA simples como os plasmídeos, podem-se construir vectores mais complexos com base em vírus, facilitando a entrada das sequências desejadas nas células alvo. Entre estes, os vectores retrovirais são muito utilizados por permitirem a integração estável do DNA no genoma da célula alvo. Se tivesse que construir um destes vectores, como faria para garantir que não há perigo de infecção e doença? Tem que se tirar do genoma do virus a parte responsavel pela parte infecciosa do virus, e só manter as partes que são importantes para a entrada do genoma viral na celula e sua integração no genoma do hospedeiro. Assim integra-se o fragmento que se pretende no genoma do hospedeiro sem que haja perigo de infecção ou doença.