UA Biophysics:Protocols:Carotenoid Extration ESP

Materiales para 6 gramos de célula

• Preparar centrífuga a 4 grados
• 200 ml Metanol. Opcional: Agregar 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol 0.1 % w/V (250 mg/250 ml) Para la extracción de carotenos, ya que los protegen de oxidación
• 500 NaCl 1,7 M (99.348 g/1 L)
• 200 Acetato de etilo (Mejor si esta destilado ya que tiende a ser muy hidrófilo)
• Opcional Na2SO4 anhidro (1 g/ 500 ml de solución)
• Cloroformo

Procedimiento

Dia 1:

1. Macerar con mortero y pistilo las células y dividir en 6 falcón de 50 ml colocando un gramo en cada uno.
2. Por cada 50 mg de células agregar 1 ml de metanol (En cada falcón 20 ml de metanol).
3. Vortex 5 min con perlas de vidrio (10 perlas grandes en cada falcon).
4. Centrifugar 15 min a 8500 rpm a 4°C.
5. Transferir el sobrenadante a un nuevo falcón
6. Con el pellet hacer re extracción agregando la mitad del volumen de Metanol que se usó en la primera extracción y nuevamente 5 min de vortex (Por falcon 10 ml de metanol)
7. Transferir el metanol a un embudo de decantación (Para 3 gramos de célula se usa un embudo de 500 ml)
8. Agregar acetato de etilo (1:1 con metanol) y mezclar 15 segundos (90 ml de acetato de etilo:90 ml de metanol a cada embudo)
9. Agregar la solución de NaCl (1:1 con metanol). (90 ml para cada embudo)
10. Agitar durante los primeros 15 min, luego dejar reposar 30 min. El embudo lucirá como la de la imagen inferior.
11. Recoger el metanol para hacer re-extracción.
12. Recoger la fase de acetato de etilo en un balón de 500 ml
13. Al methanol/H2O que queda del paso anterior se le agrega nuevamente acetato de etilo para terminar de separar carotenos que hubieren quedado.
14. Recoger el acetato de etilo
15. Rotoevaporar

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Separación acetato de etilo/metanol/agua

Día 2

1. Re disolver el contenido en cloroformo metanol (2:1) para separar proteínas y agitar (Para 6 gramos de célula se agregan 60 ml de cloroformo/ 30 ml de metanol)
2. Agregar solución salina (1:1 metanol) y agitar (30 ml para los 6 gramos de célula)
3. La emulsión resultante se centrifuga en tubo de vidrio a 2000 rpm por 15 min a 4°C
4. La interfaz blanca es proteína, en la parte de arriba está el metanol con agua y abajo está el cloroformo con los carotenos. Ver figura abajo
5. Con pipeta se retira el metanol/agua
6. Se une todo el volumen disponible de cloroformo en balón
7. Recoger el cloroformo en balón Se debe estar seguro que no se pase agua, solo el cloroformo
8. Roto evaporar

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Separación acetato de etilo/metanol/agua

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