UA Biophysics:Protocols:Carotenoid Extration ESP
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Materiales para 6 gramos de célula
- Preparar centrífuga a 4 grados
- 200 ml Metanol. Opcional: Agregar 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol 0.1 % w/V (250 mg/250 ml) Para la extracción de carotenos, ya que los protegen de oxidación
- 500 NaCl 1,7 M (99.348 g/1 L)
- 200 Acetato de etilo (Mejor si esta destilado ya que tiende a ser muy hidrófilo)
- Opcional Na2SO4 anhidro (1 g/ 500 ml de solución)
- Cloroformo
Procedimiento
Dia 1:
- Macerar con mortero y pistilo las células y dividir en 6 falcón de 50 ml colocando un gramo en cada uno.
- Por cada 50 mg de células agregar 1 ml de metanol (En cada falcón 20 ml de metanol).
- Vortex 5 min con perlas de vidrio (10 perlas grandes en cada falcon).
- Centrifugar 15 min a 8500 rpm a 4°C.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo falcón
- Con el pellet hacer re extracción agregando la mitad del volumen de Metanol que se usó en la primera extracción y nuevamente 5 min de vortex (Por falcon 10 ml de metanol)
- Transferir el metanol a un embudo de decantación (Para 3 gramos de célula se usa un embudo de 500 ml)
- Agregar acetato de etilo (1:1 con metanol) y mezclar 15 segundos (90 ml de acetato de etilo:90 ml de metanol a cada embudo)
- Agregar la solución de NaCl (1:1 con metanol). (90 ml para cada embudo)
- Agitar durante los primeros 15 min, luego dejar reposar 30 min. El embudo lucirá como la de la imagen inferior.
- Recoger el metanol para hacer re-extracción.
- Recoger la fase de acetato de etilo en un balón de 500 ml
- Al methanol/H2O que queda del paso anterior se le agrega nuevamente acetato de etilo para terminar de separar carotenos que hubieren quedado.
- Recoger el acetato de etilo
- Rotoevaporar
Día 2
- Re disolver el contenido en cloroformo metanol (2:1) para separar proteínas y agitar (Para 6 gramos de célula se agregan 60 ml de cloroformo/ 30 ml de metanol)
- Agregar solución salina (1:1 metanol) y agitar (30 ml para los 6 gramos de célula)
- La emulsión resultante se centrifuga en tubo de vidrio a 2000 rpm por 15 min a 4°C
- La interfaz blanca es proteína, en la parte de arriba está el metanol con agua y abajo está el cloroformo con los carotenos. Ver figura abajo
- Con pipeta se retira el metanol/agua
- Se une todo el volumen disponible de cloroformo en balón
- Recoger el cloroformo en balón Se debe estar seguro que no se pase agua, solo el cloroformo
- Roto evaporar