Etchevers:Notebook/Embryos/2009/07/17
Angélique a fait ce protocole sur des coupes de peau embryonnaire/foetale humaine suivantes:
0600137B - 29 (12sd)
0600137E -77
R1059 - 74 (7sd)
e0600262 - 20 (38sd)
090007A - 23 (12sd)
Celles-ci sont adjacentes a celles que j'ai envoyees a Sandrine pour c-kit.
1. Déparaffiner les coupes 5 um :
2x 5’ xylène (or toluene or Histoclear)
2x 2’ 100% EtOH
2’ 95% EtOH
2’ chacun: 70%, 50%, 30% EtOH
Passage dans de l’eau
Passage PBS
2. 30’ dans 0,5 M chlorure d’ammonium dans du PBS (amidimation des aldehydes libres) – ou glycine 50 mM à la place.
3. Faire 3 lavages de 5’ dans du PBS + 0,1% Tween-20 (PBT)
4. Démasquage d’antigènes: faire bouiller 0.01M Na citrate pH 6 dans de l’eau.
5. Mettre les lames dans le bain pour 20’. Refroidir doucement puis remettre PBS TA
6. Bloquer à 10% sérum de veau foetal dans du PBT pour 30’ sans lamelle, sous parafilm éventuellement.
7. Sortir le Progold+DAPI du congélateur
8. Anti-tyrosinase 1:100 dans 2 % serum/PBS (se trouve a 4ºC dans tiroir de droite)
- 75 ul par lame en chambre humide sous lamelle ou Parafilm
- Incuber 1 à 2 hours TA.
9. Rincer 5x PBS pendant 5’
10. Deuxième anticorps: anti-IgG2a-555 (1:200) sous lamelles/Parafilm pendant 1 heure TA:
5 ul anticorps
pour 1 ml PBS
11. Rincer 5x PBS pendant 5’.
12. Monter les lames au Progold + DAPI. Ne pas mettre de vernis avant lundi. Garder au noir a température ambiante le reste de l’après-midi (16h - 17h30) puis ranger au frigo.
- Heather 12:51, 16 July 2009 (EDT):
