Etchevers:Notebook/Embryos/2009/07/17

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Angélique a fait ce protocole sur des coupes de peau embryonnaire/foetale humaine suivantes:

0600137B - 29 (12sd)

0600137E -77

R1059 - 74 (7sd)

e0600262 - 20 (38sd)

090007A - 23 (12sd)

Celles-ci sont adjacentes a celles que j'ai envoyees a Sandrine pour c-kit.


1. Déparaffiner les coupes 5 um :

    2x 5’ xylène (or toluene or Histoclear)
    2x 2’ 100% EtOH
    2’ 95% EtOH 
    2’ chacun:  70%, 50%, 30% EtOH
    Passage dans de l’eau
    Passage PBS 

2. 30’ dans 0,5 M chlorure d’ammonium dans du PBS (amidimation des aldehydes libres) – ou glycine 50 mM à la place.

3. Faire 3 lavages de 5’ dans du PBS + 0,1% Tween-20 (PBT)

4. Démasquage d’antigènes: faire bouiller 0.01M Na citrate pH 6 dans de l’eau.

5. Mettre les lames dans le bain pour 20’. Refroidir doucement puis remettre PBS TA

6. Bloquer à 10% sérum de veau foetal dans du PBT pour 30’ sans lamelle, sous parafilm éventuellement.

7. Sortir le Progold+DAPI du congélateur

8. Anti-tyrosinase 1:100 dans 2 % serum/PBS (se trouve a 4ºC dans tiroir de droite)

  • 75 ul par lame en chambre humide sous lamelle ou Parafilm
  • Incuber 1 à 2 hours TA.

9. Rincer 5x PBS pendant 5’

10. Deuxième anticorps: anti-IgG2a-555 (1:200) sous lamelles/Parafilm pendant 1 heure TA:

    5 ul anticorps
    pour 1 ml PBS 

11. Rincer 5x PBS pendant 5’.

12. Monter les lames au Progold + DAPI. Ne pas mettre de vernis avant lundi. Garder au noir a température ambiante le reste de l’après-midi (16h - 17h30) puis ranger au frigo.