Biomod/2012/TeamSendaiVer.Y/Experiment

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Selector

Idea

セレクターは奥に進むほどターゲット分子と配列の一致が多くなるように設計する。このことにより、筒形の構造体の内部にセレクターを生やすことで、ターゲット分子を徐々に奥に送り出すということが可能となる。
セレクターにどのように番号を振り、どのように働いてくれたら嬉し いのかの図（できれば動画）をください。

The DNA sequences

<img src="http://openwetware.org/images/9/97/Format_Selector_sequence.jpg" alt="selecotor sequence" width="800" height="324"/>

このような配列でセレクターを作りました。
この構造にしたのはこういう理由です。
それぞれがターゲットとどのような構造を作って結合するのか絵が欲しい。配列の表、もっと小さくていい。

Electrophoresis

Condition
constant voltage: 50V
temperature: 4℃(in refrigerater)
time: 2 hours
SYBR Gold as a stain for 10 minutes
1X TAE added to Mg2+ as a buffer
1 Target
2 Selector1
3 Selector2
4 Selector3
5 Target + Selector1
6 (Target + Selector1)+Selector2
7 (Target + Selector1)
+
Selector2 + Selector3
8 Target + Selector2
9 Target + Selector3
10 Marker

<img src="http://openwetware.org/images/a/a9/Format_9-4_erectrophoresis_new.jpg" alt="selecotor electorophoresis" width="483" height="427"/>

セレクタに希望通りの機能を持たせることができているのか電気泳動で調べた。レーン１から４は比較のためにターゲットとセレクタ１から3を流した。また、レーン８と９はターゲットとセレクター２，３の混合溶液をそれぞれ混ぜたものである。このレーンのバンと同じ高さに現れたバンドはそれぞれのセレクタとターゲットの混合物であるということができる。
レーン5はターゲットとセレクタ１を混ぜたものである（放置時間１h?）。薄いが、セレクタ１の上にバンドが見える。これをターゲットとセレクタ１がハイブリしたものと判断した。
レーン６はターゲットとセレクター１を混ぜ、放置したあと、セレクター２を混ぜたものである。セレクター１とターゲットの重合体のバンドは消え去り、代わりに、セレクター２のバンドよりも高い位置に新たなバンドができたことがわかる。このバンドがレーン８のターゲットとセレクタ２の重合体と同じ高さにあることから、セレクター１からセレクター２へのターゲットの移動は成功していると考えられる。
レーン７はターゲットとセレクター１を混ぜ、放置したあと、セレクター２と３を混ぜたものである。ターゲットとセレクター２、ターゲットとセレクター３の重合体が出来ていることがわかる。このことから、セレクター１からセレクター２、さらにセレクター３への移動は成功していると考えられる。
以上のことから、我々の考えたセレクターの動作原理、ターゲット分子の送り出しは機能するものと判断した。

セレクターで筒の中にターゲットを運べるかの実験

蛍光のついたターゲットを発注。
取り込み：筒とターゲットを混ぜて泳動させる。筒を染色せずに蛍光を見ることで、ターゲットが筒と結合しているかどうかわかる（筒の位置とターゲットのみの位置にバンドが見えるはず）。さらに、S1を生やすか生やさないかで条件づけをすれば、S1のループ構造が優位か優位でないか確認できる。
吐き出し：筒の入口にS3を生やし、そこにターゲットがくっついた状態で、S4を入れる。すると、S4とターゲットが結合し、筒からターゲットが離れるため、電気泳動した場合にS4を混ぜた場合と違う結果が出るはず。このことが筒からの吐き出しもできるという証明にならないか。
取り込みと吐き出しができるということを証明して、セレクターの機構が筒の中で正常に働くという証明にする。

Gate

Idea

セレクターは細胞膜に刺さらなければならない。だからこんな構造にした。等などいろいろ書くことありそう。

Design

caDNAnoの画像と配列、アニーリング時間など。

Electrophoresis

電気泳動の画像

AFM Images

Membrane

Idea

脂質膜にDNAでできた筒を刺すことを最終目標にする。
確認方法として、リポソームに蛍光色素を入れておく。筒と混ぜた時に色素が抜けていれば穴が開いた証拠になる。
筒の横から短いステイプルを伸ばし、そこに疎水基あるいはコレステロールを修飾することで、筒が刺さりやすくなるのではと考えている。

Design

脂質の配合はDOPC、DSPE-PEG2000、フルクトース、クロロホルム。乾燥させたものを1×TAE Mg2+で戻す。

蛍光顕微鏡

リポソームができているかをを観察する。ポジコン、ネガコンを用いる。


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