User:Ana Luisa Van Innis/Notebook/Caderno BioMol/2010/03/23

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==PCR e RT-PCR==

Introdução

A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.


Questões

  *Que características deve ter um primer de PCR?

- Os primers devem ser comoplementares à sequencia de DNA - O primer escolhido tem que ser unicamente selectivo para uma dada região do DNA ( por isso deve ter um comprimento minimo de 20 nucleotidos), de forma a evitar a possibilidade de este se ligar a outras zonas vizinhas semelhantes do DNA. De igual modo, os primers nao devem ser excessivamente compridos - O conteúdo no primer em G-C e T-A tem que ser equilibrado (ratio de 40 a 50%), pois as ligações G-C são mais fortes (3 pontes de Hidrogenio) em comparaçao as ligaçoes A-T (2 pontes de hidrogenio). Se a quantidade de G e C for muito superior às de A e T, corremos o risco do primer se ligar numa zona não desejada e não totalmente complementar (mismatching) devido à força de ligação das 3 pontes de Hidrogenio. De igual modo, se o teor de G e C no primer for muito elevado, também corremos o risco de este ficar fortemente ligado à sequencia de DNA (mais uma vez devido às 3 pontes de hidrogenio), o que vai fazer com que se utilizem Tm muito mais elevadas na ronda seguinte para separar as duas cadeias. -Os dois primers devem ter Tm semelhantes e deve ser uma Tm adequada (não muito mais elevada que a temperatura de annealing de forma a evitar erros de hibridação e extensão do primer num local errado como nem deve ser muito mais baixa que a temperatura de annealing de forma a não correr o risco do primer não se ligar sequer à sequencia de DNA) - Os primers não devem emparelhar uns com os outros nem com eles próprios, de forma a evitar, respectivamente, a formação de dímeros de primers (incapazes de se ligarem à sequencia de DNA) assim como a formação de hairpins ou loops (que impedem também a ligãção ao DNA).

  *Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

- Se o mRNA contêm uma cauda poly-A no terminal 3´, podemos usar um primer oligo-dT de forma a ligarem-se simultaneamente a todos os mRNAs. - Se apenas queremos reproduzir o cDNA de uma zona especifica de um mRNA, podemos usar um primer especifico de gene, de forma a ligar-se apenas à dada sequencia do mRNA. - Se queremos reproduzir o cDNA de sequências dispersas ao longo de todo o mRNA, temos de usar uma mistura de random primer (de preferencia todas as combinações de primers com aqueles nucleotidos), formando fragmentos de cDNA de toda a sequencia de mRNA (ou seja o cDNA não terá o comprimento final).

  *Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Reacção de PCR com sequênciação do produto amplificado (o gene da beta-globina neste caso).

Passo 1: Extracção de DNA genómico (gDNA)

Inicialmente é necessário obter uma amostra celular do doente. Uma maneira relativamente fácil é usar um esfregaço da mucosa oral. Para extrair o gDNA pode usar-se um Kit comercial (ex:http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_mini_man.pdf).

Passo 2: Reacção de PCR Para a reacção de PCR podemos usar também um kit comercial (ex: http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_ep0701.pdf). É necessário escolher primers eficientes que cubram toda a região pretendida, e que sejam específicos. Uma maneira de desenhar primers é utilizar ferramentas bioinformáticas, que têm em conta parâmetros termodinâmicos e permitem o design de primers robustos. (como o Primer-Blast da NCBI).

Neste caso, um exemplo de primers, escolhidos manualmente e que abrangem todo a sequência: Primer esquerdo: GTGTGTATATATATA. Primer direito: TTTTTCCCTTACACC.

Depois da amplificação podia fazer-se uma electroforese em gel de agarose para selecionar apenas os fragmentos amplificados, e evitar que depois primers e fragmentos de amplificação incompleta aparecessem na sequênciação, bem como verificar se a amplificação correu bem.

Passo 3: Sequênciação por método de Sanger, usando por exemplo o primer esquerdo da PCR.

  *Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Passo 1: Extracção de mRNA. Neste caso seria necessário fazer uma colheita de sangue. Depois de feita a colheita poderia usar-se um kit comercial de purificação de RNA apropriado (ex: http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM1928). Trabalhar com RNA é mais complicado do que DNA, è necessário evitar entre outras coisas a acção das RNAses.

Reacção de PCR

Para a transcrição reversa podia usar-se um primer de oligo-dT, que ligaria à cauda Poly-A, e um kit comercial como o exemplificado com os reagentes necessários. Depois de terminada a síntese de cDNA, faríamos uma reacção de PCR com um protocolo em tudo idêntico ao descrito anteriormente, excepto nos primers, e em seguida sequênciação (tal como no seguimento da questão anterior). Como primers para esta amplificação, poderiamos mais uma vez usar ferramentar informáticas (até se poderia optimizar as temperaturas dos primers de forma a conseguir fazer cDNA e amplificação seguidas, no mesmo tubo, em vez de em dois passos). Dois possíveis primers para esta reacção seriam um primer oligo-dT para o primer direito ou inverso e para o primer directo ou esquerdo: TGTAAACGAAGACT (design manual).




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