User:Ana Isabel F. Simoes/Notebook/Ana Simoes-biomol/2010/05/11

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TP8

Clonagem molecular

A utilização de enzimas de restrição e vectores de DNA permite criar moléculas de DNA recombinantes e cloná-las em bactérias.


As bactérias transformadas com uma única molécula de DNA plasmídeo podem ser isoladas em placas de petri graças ao gene de resistência presente no vector.,

Em seguida, podem ser multiplicadas em culturas líquidas de pequena, média ou grande escala e utilizadas como "fábricas" de DNA, de onde se pode purificar o vector plasmídico, separando-o do DNA genómico e proteínas bacterianas pelo método da lise alcalina.


Consultar página original das imagens

O DNA presente em cada colónia bacteriana pode ser analizado por digestão com enzimas de restrição, para confirmar que contém a sequência desejada.

O DNA assim purificado pode ser introduzido noutras células (por exemplo, em células humanas) para, por exemplo, expressar a proteína codificada pelo gene clonado.



Questões

1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo.

Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

Número de cópias no organismo humano=2*1013=2026 Número de cópias no plasmídeo=700*5*109*1000=381500000

2. Considere os seguintes vectores:


2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique.

Escolheria o vector B, uma vez que tem promotor, o que permite a transcrição da proteina humana.


2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:

Escolheria a segunda versão do fragmento de DNA da proteina, uma vez que as suas extremidades estão contidas no local de policlonagem do vector, e como são diferentes não há risco de o gene do vector se fechar sem a sequência da proteina, e também não há possibilidade desta sequência se inserir ao contrário.


3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.


3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Introduziria a sequência no local de policlonagem, na zona da Bam HI. Como o fragmento a introduzir tem extremidades iguais, existe posisibilidade da introdução ocorrer no sentido contrário, ocorrendo uma troca na ligação das extremidades.


3.2 Como procederia para resolver o problema? A resolução do problema poderia ser feita através da análise de vários vectores introduzidos na célula. Assim, para garantir que o fragmento é introduzido no sentido correcto, iremos proceder ao corte da sequência com a enzima Kpn1 e Eco RI e ver qual o tamanho dos fragmentos (por electroforese). Os fragmentos obtidos assim têm tamanhos distintos e permitem verificar se a sequencia se encontra presente e no sentido correcto.


3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.


Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

Funcionou, pois obtiveram-se dois fragmentos (~800 pb e ~4500 pb) na pista 3 (Eco RI e Kpn I), e como tal podemos concluir que não houve erros na inserção do fragmento.

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