User:Ana Claudia De O. Manata/Notebook/Aulas TP Bio Molecular/2010/05/11

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Clonagem molecular

A utilização de enzimas de restrição e vectores de DNA permite criar moléculas de DNA recombinantes e cloná-las em bactérias.

Molclo2.png

As bactérias transformadas com uma única molécula de DNA plasmídeo podem ser isoladas em placas de petri graças ao gene de resistência presente no vector.,

Em seguida, podem ser multiplicadas em culturas líquidas de pequena, média ou grande escala e utilizadas como "fábricas" de DNA, de onde se pode purificar o vector plasmídico, separando-o do DNA genómico e proteínas bacterianas pelo método da lise alcalina.

Miniprep en.png

Consultar página original das imagens

O DNA presente em cada colónia bacteriana pode ser analizado por digestão com enzimas de restrição, para confirmar que contém a sequência desejada.

O DNA assim purificado pode ser introduzido noutras células (por exemplo, em células humanas) para, por exemplo, expressar a proteína codificada pelo gene clonado.


Questões

1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo.

Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

Poderão ser extraídas 2x1013 cópias de um gene de uma pessoa. Enquanto que de um litro de cultura de bactérias poderão ser extraídas 700x1000x5 x109 = 35x1014 cópias de um gene.


2. Considere os seguintes vectores:

File:TP8 2.jpg

2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique.

Escolheria o vector B, uma vez que o pretendido é a expressão do gene e a produção de proteína, e para tal é necessário um promotor.

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

File:TP8 3.jpg

Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:

File:TP8 4.jpg

Escolheria Bam HI - Eco RI, para permitir a inserção na zona de policlonagem, uma vez que seria possível a ligação dos fragmentos nas duas extremidades.


3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.

File:TP8 5.jpg

3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Usaria a enzima de restrição Bam HI, o que possibilitaria a sua inserção. No entanto, não é possível garantir a introdução na posição/sentido/orientação correcta uma vez que as duas extremidades do fragmento são iguais.

3.2 Como procederia para resolver o problema?

Isolaria colónias de bactérias nas quais ocorreu o processo de clonagem, tratava com as enzimas de restrição Kpn I e Eco RI e faria uma electroforese para distinguir em quais das colónias o fragmento foi bem inserido. No caso em que o fragmento é bem inserido a pista de electroforese conteria uma banda com 800 pb e outra com 4500 pb. No caso em que o fragmento está invertido a pista conteria uma banda de 120pb e outra de 5510pb. No caso em que não há introdução do fragmento a pista terá apenas uma banda de 4700pb.

3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp); na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

File:TP8 6.jpg

Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

A clonagem funcionou uma vez que na pista com a Eco RI e Kpn I obtem-se 2 fragmentos, um aproximadamente de 800 pb e outro de 4500 pb, o que indica que o fragmento foi bem inserido.