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Etchevers:Extraction ARN francais: Difference between revisions
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Etchevers:Extraction ARN francais (view source)
Revision as of 13:54, 17 December 2006
, 17 December 2006→Technique
m (→Technique) |
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*Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus. | *Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus. | ||
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===Technique=== | ===Technique=== | ||
Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT | '''Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT''' | ||
1- Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus. | 1- Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus. | ||
| Line 43: | Line 45: | ||
7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!). | 7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!). | ||
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Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy | '''Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy''' | ||
8- Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml. | 8- Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml. | ||
| Line 52: | Line 54: | ||
10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne. | 10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne. | ||
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Etape 3 : Digestion à la DNase | <br> | ||
'''Etape 3 : Digestion à la DNase''' | |||
11- Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy. | 11- Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy. | ||
| Line 70: | Line 73: | ||
17- Eliminer l’éluat. | 17- Eliminer l’éluat. | ||
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Etape 4 : Lavages | <br> | ||
'''Etape 4 : Lavages''' | |||
18- Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube. | 18- Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube. | ||
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22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute. | 22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute. | ||
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Etape 5 : Elution | <br> | ||
'''Etape 5 : Elution''' | |||
23- Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml. | 23- Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml. | ||
