User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/16
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Sequenciação de DNAIntroduçãoAs sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.
Questões
É necessário a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (que é complementar à sequência de DNA), DNA polimerase (enzima) e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, T, C e G). À mistura também se adiciona outro tipo de nucleótidos, didesoxinucleótidos (ddNTP)
A cadeia sequenciada é a 5'->3' e as cadeias obtidas na sequenciação serão iguais a esta. O primer a utilizar deve ser complementar da cadeia molde (3´->5´), dado que a polimerização ocorre de 5'->3'.
A síntese da cadeia não é continuada indefinitivamente pois a mistura contém pequenas quantidades de didesoxinucleótidos, que bloqueiam a elongação. Isto deve-se ao facto dos ddNTP terem um átomo de hidrogénio ligado ao carbono 3´, em vez de um grupo hidroxilo.
A quantidade de dNTP é bastante maior do que a de ddNTP, o que leva a uma incorporação probabilística com vantagens dos dNTP, obtendo-se cadeias de diferentes comprimentos e com número considerável de nucleótidos.
Podem existir problemas tanto ao nível da polimerização como ao nível da resoluação da electroforese. A capacidade de polimerizar fragmentos com mais de 350-400 nucleótidos é reduzida, o que é observado no electroferograma pela fraca intensidade dos picos. Além disto, os picos correspondentes aos fragmentos de menor e maior comprimento não têm uma boa resolução, porque na electroforese são devidamente delimitados.
Adicionando primers complementares a diferentes distâncias da cadeia. Quando na sequência estão porções desconhecidas, utiliza-se o final de uma cadeia polimerizada anteriormente para a construção do primer.
T vermelho A verde G preto C azul Ind. 1 - TCGTGTTCTATGATCATGAGGTCGCCG Ind. 2 - TCGTGTTCTATGATC/GATGAGGTCGCCG -> heterozigotia
Para sequenciar o gene recorre-se a um procedimento semelhante ao analisado. Quanto à amostra biológica poderá ser de qualquer tecido uma vez que todas as células têm no genoma este gene. Para sequenciar o mRNA será necessário obter cDNA,uma vez que só este pode ser sequenciado e criar primers complementares ao mesmo. Quanto à amostra biológica o mais fácil será recolher uma amostra de sangue que contém as cálulas que expressam o gene em questão.
Para pensar
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