FCCT Biochemistry Lab:Courses:TrDNA-vaje

From OpenWetWare

Jump to: navigation, search

TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNAvaje

[10.6.] Kolokviji pri doc. Dolinarju so možni do 17.6. in nato ponovno od 8.7. naprej. 
Najaviti se morate vsaj 5 dni pred želenim rokom, da ga sploh lahko razpišem na e-študentu.
V času, ko ni predavanj, tudi ni rednih govorilnih ur, lahko pa se najavite na konzultacije v času, 
ko sem prisoten - okvirni razpored zasedenosti je na mojem koledarju. 

Tehnologija rekombin. DNA: vaje (FKKT UL)


Vaje: 60 ur, poletni semester 4. letnika univerzitetnega študija biokemije; samo za študente sklopa A. Vaje so se začele konec marca v dveh skupinah. Seznam študentov po skupinah je bil objavljen na oglasni deski FKKT 5. marca.

Predavanja:  opis na posebni strani

Vodji vaj: doc. dr. Marko Dolinar in asist. dr. Petra Prijatelj Žnidaršič.

Urnik vaj 2008/09: Vaje bodo potekale v dveh skupinah. Vsaka skupina pride na vaje dvakrat tedensko za po 5 šolskih ur, razen v marcu in aprilu, ko bodo vaje enkrat tedensko.

Zasnova vaj: Od 8 vaj je ena računalniška, 7 pa laboratorijskih (od teh dve demonstracijski). Osrednji del vaj predstavlja projekt priprave rekombinantnih bakterij in analiza rekombinantnega proteina. Najprej si boste pripravili izhodna plazmida (klonirnega z zapisom za protein, ki ga želimo izraziti v bakterijah, in ekpresijskega), potem ju boste razrezali z encimoma in fragment z zapisom za protein ligirali v vektor. Pripravili boste kompetentne celice in jih transformirali z ligacijskim produktom. Kolonije, ki bodo zrasle na selektivnem gojišču, boste analizirali in izvedli indukcijo izražanja v malem merilu. Proteine iz rekombinantnih bakterij boste ločili z elektroforezo ter določili, ali je rekombinantni protein topen ali netopen. Na koncu boste topnim proteinom določili biološko aktivnost. Zadnji del vaj prestavlja poskus, v katerem boste izolirali svojo genomsko DNA in ob uporabi specifičnih začetnih oligonukleotidov pomnožili variabilno zaporedje na 3. kromosomu. Po analizi dolžin pomnoženih segmentov bomo ugotavljali, kako smo si različni na ravni DNA in kako bi lahko postopek uporabili v forenziki.

Vajalnica: študentski laboratorij biokemije na Institutu "Jožef Stefan" in računalniška učilnica FKKT.
Govorilne ure: četrtek ob 16:00 ali ob drugem času po predhodnem dogovoru po telefonu (01)214-9480 (Marko Dolinar) oziroma sreda 15:00 ali po dogovoru (01)477-3204 (Petra Prijatelj Žnidaršič); oglasite se na Institutu Jožef Stefan, stavba B, soba B109 (M.D.) oziroma B406 (P.P.Ž.).
Kolokvijski roki: po končanih vajah individualno po dogovoru z asistentom.

Teme po datumih:
(št. leto 2008/09)


datum
tema
6.4.(1.sk.)/31.3.(2.sk.) 1. vaja: Primerjava metod za izolacijo plazmidov iz bakterijskih celic.

1. 4. 2. vaja -  v računalniški učilnici na dekanatu: načrtovanje oligonukleotidov, restrikcijska analiza DNA, kombiniranje zaporedij, konstruiranje ligacijskih produktov, oblikovanje fuzij, viri informacij o vektorjih in drugih zaporedjih DNA.
15.4. (1.sk.)/8.4. (2.sk.) nadalj. 1. vaje: Vpliv dodatkov na čistost preparatov DNA. Gelska elektroforeza na agaroznem gelu - analiza izolacije plazmidov. Rezultati (negativi slik): 1. skupina - 1 % in 2 % gel, vloga dodatkov mali gel / veliki gel ; 2. skupina - V1s2g1, V1s2g2.
20.4.(1.sk.)/14.4.(2.sk.) 3. vaja: Izolacija večjih količin plazmidov iz bakterij.
22.4. (1.sk.)/21.4. (2.sk.)
nadalj.: Elektroforezna analiza. Rezultati (negativi slik): 1. skupina - 1 % AGE; 2. skupina - V3s2
4. vaja: Preparativno rezanje DNA z restrikcijskimi endonukleazami - 1. stopnja in elektroforezna analiza. Rezultat (negativ): 1. skupina - 1 % AGE; 2. skupina - V4s2g1. Uporabljeni označevalec velikosti je "GeneRuler 1 kb DNA Ladder".
4. in 5. 5. nadalj.: 2. stopnja rezanja. Preparativna elektroforeza in izolacija fragmentov DNA iz agaroze (negativ): 1. skupina - 1 % AGE in 2 % AGE pred izrezom DNA; 2. skupina - 1 % AGE in 2 % AGE. Standardi velikosti so kot zgoraj (na 1 % gelu) in '100 bp ladder' (na 2 % gelu). Ligacija.
6. in 7. 5. nadalj. 4. vaje: Priprava kompetentnih celic. Transformacija bakterij.
6. vaja: Izolacija DNA iz majhnega števila človeških celic. Pomnoževanje s PCR.
11. in 12. 5. nadalj. 4. vaje: Analiza transformacije in precep transformant.
nadalj. 6. vaje: Ločevanje PCR-produktov s PAGE in analiza pomnoženih STR - rezultati: 1. skupina - 7 % gel; 2. skupina - 8 % gel. Ločevanje PCR-produktov z AGE in analiza pomnoženih VNTR v regiji D1S80 - rezultati: 1. skupina - 1,75 % gel. Uporabljeni standard velikosti ima lise, kot so prikazane na strani proizvajalca.
13. in 14. 5. nadalj. 4. vaje: Analiza transformant - rezultati: 1 % gel.
nadalj. 6. vaje: Ločevanje PCR-produktov z AGE in analiza pomnoženih VNTR v regiji D1S80 - rezultati: 2. skupina - 1,75 % gel.
18. in 19.5. 5. vaja: Analitska indukcija izražanja rekombinantnega zapisa.
7. vaja: Določanje nukleotidnega zaporedja.
20. in 21. 5. nadalj. 5. vaje: Priprava celičnih lizatov, periplazemske frakcije in celičnega ostanka (alternativni poskus) oziroma topne in netopne frakcije. NaDS-PAGE celičnih lizatov - analiza celotnih lizatov pred in po indukciji izražanja: skupina 1 - gel 1, gel 2; skupina 2 - gel 1. Označevalci velikosti so predstavljeni na spletni strani proizvajalca.
25. in 26.5. nadalj. 5. vaje: NaDS-PAGE periplazemskih frakcij in celičnih ostankov. Rezultati PAGE: 1. skupina - gel 1, gel 2; 2. skupina - gel 1, gel 2. Test aktivnosti na papain.
8. vaja: Prenos fragmentov DNA z gela na membrano [demonstracijska vaja].

----

Študijska literatura:
Navodila za vaje v formatu PDF (64 strani).

Cilji:
Pričakujem, da boste po opravljenem kolokviju znali samostojno narediti načrt in izvesti osnovne reakcije, potrebne pri manipuliranju z DNA. Predvidevam, da bi morali biti sposobni ponoviti nekatere eksperimente, opisane v metodološkem delu strokovnih člankov s področja molekularne biologije, ki vključuje gensko-tehnološke pristope. Načrtovanje oligonukleotidov, postopki pri pripravi fuzij ipd. bi morali biti v osnovi jasni.

Potek vaj:
Vaje bodo po urniku: po 2 x 4 ure tedensko (to je po ~5 šolskih ur), 6 tednov. Prisotnost in sodelovanje na vajah je obvezno.
Pred vajo bo kratek teoretični uvod. Preberite si tudi vnaprej uvodne dele vsake vaje iz navodil!
Tudi na vajah želim, da vprašate, čim vam kaj ni jasno.

Laboratorijsko delo in varnost:
Zaradi dela z izredno majhnimi količinami je potrebno zelo pazljivo pipetiranje. Ker bomo delali z vektorji, ki prenašajo odpornost proti antibiotikom in z gojišči, ki vsebujejo antibiotike, je treba biti še posebej pazljiv. Mikrobiološke vzorce po končani uporabi zavržemo na posebej za to določeno mesto in na način, ki bo omogočal enostavno sterilizacijo. V postopkih bomo uporabljali kemikalije, ki so zdravju nevarne, zato upoštevajte asistentova navodila in vsa opozorila na originalni embalaži. Varnostni listi so na vpogled pri tehniku.

Poročila z vaj:
Kratka poročila napišite in oddajte do rokov, ki so vsakič v petek ob 12. uri, v maju izjemoma v ponedeljek ob 12. uri. Za vaje 2, 7 in 8 poročil ni treba pripraviti.

Poročilo sestavlja naslednje: Ime in priimek študenta, Naslov vaje, Namen vaje (po možnosti 1 stavek; namen NI enako povzetek postopka dela), Rezultati, Diskusija.

Pri vajah, za katere ste reagente pripravili sami, izjemoma vključite tudi poglavje Materiali, v katerem napišite, kako ste pripravili (zatehtali, razredčili, sterilizirali...) kateri reagent.
Pri vajah, kjer ste sami sestavili reakcijo (torej ni v navodilih), uvedite poglavje Metode in napišite shemo pipetiranja. Vseeno pa prosim, da praviloma ne opisujete postopka vaje, metode, teoretičnih osnov itd., ki so opisane v navodilih. Če je smiselno, naj bo naslov poglavja "Materiali in metode" kot je to običajno pri dizertacijah in znanstvenih člankih.
Rezultati so vsi podatki, ki ste jih dobili med vajo,  tudi vsa opažanja, ki prispevajo k razjasnitvi naloge/namena vaje.
Diskusija vsebuje razlago rezultatov, če je to potrebno. Najenostavnejši tip diskusije je: "Rezultati kažejo, da A vsebuje B, kot smo tudi predpostavili. " Če niste prišli do pričakovanega rezultata, poskušajte razložiti, kaj je temu razlog (ali je bila predpostavka napačna, ali so bili reagenti neustrezni, ali je prišlo do napake - katere? - v izvedbi postopka...).

Da bi morda v poročila ne pisali enakih napak kot vaši predhodniki, da bi pazili na pomen stavkov, ki jih zapišete in da bi preverjali svoje razumevanje snovi, sem zbral nekaj čudnih izjav iz starih poročil. Poskusite ugotoviti, kje so napake, dvoumnosti ali nerodnosti v izražanju. Pogosto opažam, da poročilo sestavite in ga takoj oddate, ne da bi ga še enkrat prebrali. Poskusite se disciplinirati do te mere, da vsako stvar, ki jo napišete, vsaj še enkrat preberete, preden jo oddate. (To vam utegne kdaj kasneje priti še dosti bolj prav, kot pri vajah...)

Ocenjevanje:
Poročil z vaj verjetno ne bom mogel pregledati sproti, zato jih bom ocenil šele pred kolokvijem. Povprečje ocen poročil bo prispevalo 25% končne ocene iz vaj. Pri ocenjevanju poročil bom upošteval naslednje odbitke: zamuda 1-3 ure: 0,5 ocene za posamezno poročilo, 3-72 ur: 1 ocena, zamuda nad 72 ur: 2 oceni. Če najdem prepisane dele ali celotna poročila: -1 ocena do -3 ocene pri obeh avtorjih podvojenih besedil.
Za vsa poročila, ki jih bom dobil po e-pošti, bom, ko jih bom odprl, poslal s povratno pošto potrditev, da sem priloženo poročilo lahko prebral. Če potrditve ne dobite, to najverjetneje pomeni, da vašega e-sporočila nisem dobil. V tem primeru mi čimprej pošljite popolno kopijo prvotno poslanega poročila, skupaj z glavo, iz katere bo razvidno, da ste mi poročilo poslali - svetujem, da si poštni predal nastavite tako, da kopije poročil shranite lokalno ali na strežniku vsaj za omejeno časovno obdobje. V nasprotnem primeru bom seveda upošteval odbitke za zamudo.  Prosim, da v naslovu e-sporočila ('subject') ne uporabljate znakov s strešicami, ker jih nekateri poštni strežniki ne prenesejo dobro (se je že zgodilo, da takih sporočil nisem dobil).
Kolokviji bodo individualno po dogovoru z asistentom, ki vas je imel na vajah. Ocena kolokvija predstavlja 75 % končne ocene. Kolokvij je sestavljen iz dveh delov: pribl. 30 min. je namenjenih reševanju praktične naloge: preračuni potrebnih količin encimov, načrtovanje oligonukleotidov, pristopi h kloniranju - prenosi med vektorji in podobno, sledilo pa bo par vprašanj iz snovi, ki smo jo obdelali na vajah (skupaj naj bi kolokvij trajal 45 min). Poročila torej predstavljajo 25 % končne ocene, 45 % prispeva kratka naloga, 30 % pa odgovori na vprašanja z vaj.

Možna vprašanja (gre predvsem za tip vprašanj) so:
1) Opišite princip, izvedbo in analizo reakcije PCR, v kateri pomnožujete fragment dolžine 1200 bp po matričnem plazmidu.
2) Na kaj je treba paziti pri ligaciji in kako poteka?
3) Kako bi izvedli poskus, v katerem morate prenesti zapis za karboksipeptidazo B iz klonirnega v ekspresijski vektor?

Primer kratke naloge: V vektor pET32c morate vstaviti cDNA za kokošji kininogen. Na osnovi plazmidne karte in nukleotidnega zaporedja kininogena načrtajte začetna oligonukleotida za pomnoževanje s PCR. Pazite, da bo prehod med fuzijskim delom in cDNA čimkrajši in da bo bralni okvir nespremenjen! (Ob tem dobite v pomoč nukleotidno zaporedje kininogena in plazmidno karto vektorja z zaporedjem polilinkerske regije)

Koristne povezave:

Komentarji, vprašanja in odgovori:

Na strokovna vprašanja bova poskušala odgovoriti na vajah, če pa niste najini študenti, pa na kratko tudi po e-pošti.
Pišite tudi, če katera od povezav na tej strani ne deluje več ali če veste za kakšno drugo dobro povezavo, ki bi jo veljalo vključiti.

Personal tools