Biomod/2014/UANL/Katia/ensayos preliminares/catalasa

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Catalasa .

Metodo: Espectrofotometria A240. Reducción del Peroxido de Hidrogeno

Condiciones: pH7, 25C.

Reactivos.
- Buffer fosfato de potasio dibásico thihidratado 50mM
*utilizar HCl para ajustar.
- S´ln de Peroxido de hidrogeno 0.036%
** Preparar buffer fostato usando peroxido de hidrogeno (30% (p/p)
-Catalasa 10U por corrida

*BLANCO.-. El A240 debe estar entre 0.550 y 0.520 unidades de absorbancia. Si es necesario agregar peroxido de hidrogeno para incrementar la absorbancia de el buffer fosfato para disminuir la absorbancia.

 

Procedimiento

En una mezcla de reaccion de 3.00 mL, las concentraciones finales son 50mM de Fosfato de Potasio, 0.036% (p/p) Peroxido de hidrogeno y 10 unidades de catalasa.

1. Usando un espectrofotometro con termostato, hacer blanco en contra de una cubeta conteniendo Buffer Fosfato.

2. Pipetear 2.90 mL de solucion de peroxido de hidrogeno en una cubeta


NOTA: Cada cubeta se tendra que correr una a la vez, asi que no preparar la siguiente cubeta de prueba hasta que se termine de correr la cubeta anterior.

 

3. Por cada cubeta, monitorear el A240 hasta que sea constante, y luego agregar 0.10 mL de solucion de catalasa.
4. Inmediatamente mezclar bien por inversion. Anotar el tiempo requerido para que la A240 disminuya de 0.45 a .40 unidades de absorbancia.

Tomar una lectura por segundo por aprox. 180 segundos.

REFERENCIA: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-catalase.html

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