User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/23

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TP4-PCR e RT-PCR

Questões

  • Que características deve ter um primer de PCR?.

São necessário dois primers, um complementar da cadeia 5' ou upstream e outro da 3' ou reverse. Devemos ter em conta o tamanho do primer, entre 18 a 30 bases; Conteúdo em GC, entre 40% a 60%; A base final, deve ser um G ou C; Na estrutura secundária, devem ser evitados hair-pins; A dimerização, os primers não devem dimerizar consigo mesmos nem com o outro primer.

  • Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Um primer específico do gene é utilizado quando queremos converter uma zona especifica do mRNA em cDNA, pode ser desvantajoso pois devido á sua especificidade se quisermos estudar mais de um gene temos de fazer vários PCR's. Um primer oligo-dT liga-se à cauda poli-A do mRNA, pode ser útil para estudar todos os mRNA's com esta cauda, no entanto caso não haja cauda poli-A estes primers não se ligam, e se a zona em estudo for muito longe da cauda a transcriptase reversa não consegue converter toda a sequência em cDNA. Um primer random pode ligar se a qualquer zona do mRNA, pode ser útil pois produz fragmentos mais pequenos de cDNA e aumenta a probabilidade da região 5' do mRNA ser transcrita.