User:Margarida Azevedo/Notebook/Margarida Azevedo/2010/04/27

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  • Exercício 1 – Extremidades e ligações

Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):

Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT

1.Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?


2.Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. 1ª

5' xxxxG GATCCxxxx 3'

3' xxxxCCTAG Gxxxx 5'

5' xxxxGG CCxxxx 3'

3' xxxxCC GGxxxx 5'

5' xxxxG AATCCxxxx 3'

3' xxxxCTTAA Gxxxx 5'

5' xxxxA GATCTxxxx 3'

3' xxxxTCTAG Axxxx 5'



3.É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?

Não visto que nenhuma das extremidades coesivas é complementar das extremidades coesivas originadas pela acção da BAM HI. 


4.Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.

Os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com BAM HI serão maiores visto que as extremidades coesivas contém mais nucleótidos. Além disso, a probabilidade de encontrar a sequência que a enzima reconhece no genoma é menor qquando esta sequência é maior. 
MAPAS DE RESTRIçÂO

1.A que correspondem as bandas azuis no gel?

A fragmentos de DNA.

2.Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?

4 fragmentos originados pela acção da PleI. 3 fragmentos pela acção da BglI. 7 fragmentos no total.

No poço com BglI conseguimos observar 3 bandas. No poço com PleI só conseguimos observar 2 bandas, o que pode acontecer porque os fragmentos têm tamanhos semelhantes. SE dois fragmentos de DNA diferem no seu tamanho apenas por uma quantidade pequena de pares de bases (por exemplo, menos de 100 pb por fragemntos maiores que 1 kb), eles correm muito próximos uns dos outros, parecendo uma única banda. 

3.Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

Usando maior concentração de agarose, connseguimos separar fragmentos com uma diferença muito pequena em termos de tamanho (menos de 100 pb).

4.Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Alterando concentração de agarose e aumentando a voltagem.

Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.

1.Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?

Sim. A enzima corta em 5 locais, logo é esperada a observação de 6 bandas (origina 6 fragmentos). A última banda corresponderá ao fragmento de 3530 pb (48510-44980).

2.Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas:


2.1.Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

DNA lambda ---- 31.6x10^5 Da 1.66x10^-27g ---- 1 Da DNA lambda = 52,456 x 10^-22g

1ª banda

DNA lambda ---- 52,456 x 10^-22g



2.2.Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

Última banda

48510 ---- 1 μg 3530 ------ x

x = 0.0728 μg

1ª banda

48510 ----- 1μg 21227 ------ x

x = 0.4376 μg

Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:


1.DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000

2.DNA x HindIII = 5500 + 4500

3.DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500

Mapa de restrição:

"|-----------------------------------|-------|------------------------------------|---------------------------------|"

       5000                         E 500   H        1500                        E      3000

Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:

1.uma enzima de corte único; APOI 2.uma enzima com dois cortes; BccI 3.uma enzima que não corta neste DNA. PsiI

O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.

1.Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.

"|---------|-------|---------------|----------------|"
              175        201


2.Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.

PCR com enzimas de restrição. Electroforese.

3.Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).

Individuo saudável: 4 bandas

Portador de mutação (heterozigótico): 5 bandas Doente (homozigótico): 1 banda