User:Leonor Quintaneiro/Notebook/Aulas de BioMol/2010/05/04

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Vectores

Os vectores de DNA permitem a replicação, transporte e/ou expressão de segmentos de DNA de interesse para células alvo. Os vectores mais frequentemente utilizados são vectores plasmídicos, moléculas de DNA circulares derivadas de sequências de DNA bacteriano extra-cromossómico e modificadas para incluir elementos genéticos de interesse.

1. Quais as características básicas que um vector plasmídico deve ter? Um vector plasmídico deve ter uma origem de replicação, de modo a ter a capacidade de se poder multiplicar, deve ter também um local de policlonagem e um gene de resistência (a um antibiótico, por exemplo) que lhe confira uma característica específica.


2. Os vectores podem ser representados pela sua sequência de DNA ou por mapas que incluem a indicação dos elementos mais relevantes presentes no vector.

Pesquise no google imagens dos vectores pUC, pGEX, pcDNA, pEGFP e o sistema pTre/pTet-On. Que diferentes características apresentam estes vectores e para que servem? O vector pUC só pode ser transcrito em procariotas porque os promotores são distintos e sobrevive muito bem em E.coli. O vector pGEX tem a particularidade de possuir quadros de leitura que estão feitos de maneira a criar proteína de fusão: GST – Proteína, sendo este um bom sistema de purificação da proteína alvo (a trombina solta o GST e deixa a proteína solta). O vector pcDNA dá para ser integrado em célula eucarióticas e, desta forma, dá para construi linhas celulares estáveis em que este vector é mantido. Este vector tem portanto promotores de vírus de mamíferos que o permitem funcionar em células humanas. O vector pEGFP tem a particularidade de qualquer gene inserido nele poder ser expresso em células eucarióticas, no entanto tem um promotor procariota e eucariota. Com este vector podemos estudar células vivas e ver o comportamento das proteínas de interesse- ex: ratinhos fluoroscentes. O sistema pTre/pTet-On permite que, após estimulo, começa-se a expressar algo (ligar/desligar a expressão genica) - switch de expressão.

3. De que forma é que um vector plasmídico é mantido na célula alvo? Como o vector plasmídico consegue expressar genes de resistências a antibióticos vai conseguir sobreviver (enquanto que as bactérias que não possuem esse factor de resistência morrem). Desta forma vai haver uma selecção natural que permite ao vector plasmídico permanecer funcional nas células alvo.

4. Para além de vectores de DNA simples como os plasmídeos, podem-se construir vectores mais complexos com base em vírus, facilitando a entrada das sequências desejadas nas células alvo. Entre estes, os vectores retrovirais são muito utilizados por permitirem a integração estável do DNA no genoma da célula alvo. Se tivesse que construir um destes vectores, como faria para garantir que não há perigo de infecção e doença? Para não haver perigo de infecção pela doença o vírus não pode ter a capacidade de se replicar na célula e também se teria de ter cuidado com o local de integração deste no DNA de modo a evitar que haja a inserção numa zona que desregule genes importantes, como por exemplo, os que regulam o ciclo celular.