User:Iolanda S. O. Santos/Notebook/Caderno de Apontamentos/2010/04/27

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Exercício TP6

Extremidades e ligações

Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):

Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT

1.Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? (apontamento: Genoma de bacterias metilado, por isso enzimas de rest n cortam o DNA bacteriano; metilase p/ cada enzima de rest k impede o corte)

O sítio de corte é sempre entre um "G" (guanina) e outro nucleótido. Sequencias palindromicas.


2.Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.

1ª:

5' xxxxG GATCCxxxx 3'

3' xxxxCCTAG Gxxxx 5'


2ª:

5' xxxxGG CCxxxx 3'

3' xxxxCC GGxxxx 5'


3ª:

5' xxxxG AATTCxxxx 3'

3' xxxxCTTAA Gxxxx 5'


4ª:

5' xxxxA GATCTxxxx 3'

3' xxxxTCTAG Axxxx 5'


3.É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?

BamHI - Sim

EcoRI - Não

Bg1II - Sim


4.Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.

Os fragmentos resultantes da acção da Hae II serão menores, visto que a probabilidade de aparecer no genoma a sequencia d reconhecimento da Hae II é superior à da Bam HI, logo os fragmentos gerados pela acção daquela serão mais pequenos.


MAPAS DE RESTRIÇÃO

1.A que correspondem as bandas azuis no gel?

fragmentos de DNA resultantes da acção das enzimas de restrição

2.Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?

4 fragmentos originados pela acção da PleI e 3 fragmentos originados pela acção da Bg1I. 7 fragmentos no total.

No poço com Bg1I conseguimos observar 3 bandas e no poço com PleI conseguimos observar apenas 2 bandas. Isto resulta do facto dos fragmentos possuirem tamanhos semelhantes e pela concentração de agarose n ser a suficiente.

3.Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

Usando maior concentraçao de agarose, conseguimos separar fragmentos com uma diferença muito pequena em termos de tamanho (menos de 100pb por ex.)

4.Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Comparar o tamanho dos fragmentos obtidos com fragmentos de tamanhos conhecidos - "ladders", que são aplicados num poço no início da electroforese.


Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.

1.Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?

Sim. A enzima corta em 5 locais, logo é esperada a observação de 6 bandas (origina 6 fragmentos). A última banda corresponderá ao fragmento de 3530 pb (48510-44980).

2.Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas:

2.1.Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

DNA lambda ---- 31.6x10^5 Da 1.66x10^-27g ---- 1 Da DNA lambda = 52,456 x 10^-22g

1ª banda

DNA lambda ---- 52,456 x 10^-22g


2.2.Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

Última banda

48510 ---- 1 μg 3530 ------ x

x = 0.0728 μg

1ª banda

48510 ----- 1μg 21227 ------ x

x = 0.4376 μg


Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:

1.DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000

2.DNA x HindIII = 5500 + 4500

3.DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500

1.Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.

>-----------------------------------|-----------|-------------------|------------------<

         5000                      E   500     H       1500        E      3000

Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:

1.uma enzima de corte único;

ApoI

2.uma enzima com dois cortes;

BccI

3.uma enzima que não corta neste DNA.

PsiI


RFLPs

1.Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.

>---------|-----|--------|-------<

           175     201

2.Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.

PCR com enzimas de restrição. A seguir -> electroforese.

3.Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).

saudavel - 4 bandas

portador - 5 bandas

doente - 1 banda