User:Goncalo Correia/Notebook/BIOMOL/2010/05/11

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Questões 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

2. Considere os seguintes vectores:

2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique.

O da direita, porque é o único que tem promotor.

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

O da direita, porque ao usar duas enzimas de restrição diferente evito a possibilidade de um fragmento se ligar em posição invertida (as pontas são iguais).


Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:


3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.

3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Para clonar teria de usar a BamHI, que é a única enzima de restrição capaz de introduzir no vector a sequência a introduzir. Isto poderia levar a um problema, o mesmo que foi referido na questão 2.2.

3.2 Como procederia para resolver o problema?

Tentaria usar o facto de existir mais abaixo do local de corte de BamHI outro local de corte com EcoRI no vector. O principal problema seria adicionar à sequência a clonar uma parte terminal que encaixasse nessa zona. 3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

Sim, porque está presente o local de restrição de EcoRI e o de KpnI, originando 2 fragmentos. Isto indica que o fragmento a clonar está presente no plasmídeo purificado.