User:Goncalo Correia/Notebook/BIOMOL/2010/03/16

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TP 3

  * O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

Primer, dNTP's, ddNTP's, DNA polymerase e DNA a sequenciar.

  * Que cadeia é sequenciada?

A cadeia onde se encontra o primer (5'-3').

  * Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

Porque são usados ddNTP's para terminar a síntese da cadeia complementar e obter fragmentos de tamanho diferente, com fluorescência de cor diferente consoante o último nucleotídeo incorporado.

  * Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

Porque como existem tanto dNTP's como ddNTP's há sempre uma probabilidade maior que 0 de obter um fragmento de um determinado tamanho. É necessário fornecer proporções de ddNTP's e dNTP's de forma a optimizar as probabilidades de obter fragmentos de tamanhos diversos que cubram toda a sequência.

  * Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?

Sobreposição de picos (Resolução) e diminuição da intensidade, mais notórios na parte final da sequênciação. A sobreposição deve-se a limitações técnicas da electroforese. A diminuição ocorre porque a probabilidade de sintetizar fragmentos maiores é menor do que a probabilidade de sintetizar os mais pequenos.

  * O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

Utilizando a informação da primeira sequênciação, podemos repartir por várias sequênciações a região a cobrir, usando primers diferentes, avançando ao longo da sequência (Primer Walking Method). Também se pode usar o método de Shotgun Sequencing: Fragmentar o ADN em pedaços de tamanhos diferentes e com sobreposições múltiplas, que depois de lidos pelo método convencional, podem ser usados para reconstruir informáticamente a sequência inteira.


  * Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

1 - TCGTGTTCTATGAT(C)ATGAGAGTCGCCG

2 - TCGTGTTCTATGAT(G)ATGAGAGTCGCCG

O segundo indíviduo é provavelmente heterozigótico na posição em que os dois diferem, C>G (no segundo o pico tem metade da intensidade e parece haver sobreposição de um pico azul e de um preto).


  *Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?

Conhecendo previamente a sequência do gene da beta-globina é relativamente fácil arranjar primers adequados para a sequênciação. No caso do mRNA, sequencia-se da mesma maneira que o DNA, mas depois de se ter criado uma sequênca de cDNA, utilizando uma transcriptase reversa.