User:Diogo Amaral/Notebook/Caderno BioMol/2010/04/20

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TP5

  • Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

especifico de gene: É um primer com DNA complementar a uma sequencia específica de mRNA e deve ser usado quando queremos sequenciar o produto da transcrição de um gene conhecido, mas se houver uma mutação na zona do primer pode não ligar.

oligo DT: É um primer de cDNA que se liga à cauda poly-A do mRNA (como a transcriptase reversa), na terminação 3' da seuquencia. A desvantagem é que se o gene for muito grande a enzima pode não conseguir chegar a extremidade 5' e consequentemente não sequenciar o local de intresse. A vantagem é que pode sequenciar mRNAs difrentes, já que a cauda de poly-A é comum.

Primer Random: É um primer de DNA com 6 a 8 nucleótidos colocados aleatóriamente e como tal não corresponde a parte que queremos sequenciar, mas pode sequenciá-las, caso os primers anteriores tenham falhado. A desvantagem é que vai criar muitas sequênciaas desnecessárias pois liga-se a todos os tipos de mRNA.

  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

1º procederia à extração do DNA genómico dos elementos da família. 2º Usava primers standart para o gene da hemoglobina (usava o nbci para achar a sequecia em 5' e 3') e fazia um PCR para amplificar a sequência 3º Separava os fragmentos por electroforese e comparava os comprimentos com um padrão. 4º Fazia uma sequenciação para identificar onde ocorreu a mutação

  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo

Era fazer um pcr ca polimerase reversa, os primers eram achados da mesma forma