User:Ana Matos/Notebook/Aulas de BioMolecular/2010/06/08

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Projecto

O nosso projecto consiste na criação de um método de terapia génica para o cancro da próstata. Existe uma proteína, Kallikrein-related peptidase 3, normalmente conhecida por Prostate Specific Antigen (PSA), que é expressa específicamente por células deste tecido,e cuja expressão é aumentada na grande maioria dos tumores da próstata, o que faz dela um bom marcador tumoral e a principal ferramenta de diagnóstico laboratorial e acompanhamento da eficácia dos tratamentos de tumores prostáticos. A nossa ideia é tomar partido desta específicidade, e acoplar num vector de DNA a expressão de uma enzima que promove a morte celular ao promotor da PSA. A enzima que usamos é a Granzyme B (GRZB), produzida por várias células do sistema imunitário (T CD8+ e NK, por exemplo), capaz por si só de activar vários mecanismos pró-apoptóticos. Se funcionar, esta terapia pode ser administrada localmente e utilizada como adjuvante. O vector que usamos é uma modificação do pcDNA 3.1, comercializado pela empresa Invitrogen. Este vector traz um promotor CMV, que temos de substituir pelo promotor do PSA (PSAP). Consultando a documentação (manual, mapa, e tabela com todos os locais de corte de enzimas de restrição, dentro e fora do local de clonagem) disponível sobre este vector, encontramos duas enzimas de restrição adequadas para a remoção do promotor CMV e posterior inserção do PSAP: Primeiro corteMluI Posição 229 Local de corte 5’ A|CGCGT 3’ Segundo Corte (dois locais)SacI Posições 819 e 928 Local de corte  5’ GAGCT|C 3’

Para obter o clone de PSAP com locais de corte adequados, usa-se a técnica de PCR, com um forward primer de 20 nucleótidos complementares e seis (local de de restrição) no meio do primer, para obter um local de corte da MIuI e um reverse primer com seis nucleótidos extra a SACI (Conferiu-se que estas enzimas não cortam o PSAP).

Forward primer : TCATCGTTAC (TGCGC|A) ATAGACACCT Reverse primer : TGGGCCTCTC (C|TCGAG) GACACATGG

Estes primers foram desenhados manualmente, partindo da uma sequência de 563 (para tentar apanhar o promotor) nucleótidos acima do mRNA da PSA, da entrezgene KLK3/NM_001030049.1/NP_001025220.1. Então, extrai-se o DNA genómico humano, a partir de uma amostra, e em seguida faz-se amplificação de PCR usando esses primers. O produto de PCR contém a sequência desejada e os locais de corte das enzimas de restrição. Em seguida, trata-se o vector pcDNA 3.1 e o produto de PCR com as enzimas de restrição MiuI e SacI, e faz-se correr num gel de electroforese. Através do tamanho, é possível selecionar apenas os fragmentos de DNA que perderam o CMV e encaixaram o PSAP. Dentro destes temos fragmentos em que o PSAP se ligou na posição 928 (perda do fragmento 819 e 928, com perda do promotor T7) e aqueles em que se manteve este fragmento, ligação do PSAP no local 819. É preferível selecionar os segundos. A GRZB encaixa-se nos locais de policlonagem do vector (A referência da sequência desta enzima é NC_000014.8), através do mesmo método usado para o PSAP.


Enzimas de restrição:

AflII 909 : 5’ C|TTAAG 3’ Forward Primer: TCTCCGTCAC(C|CATGG)CCCCACCCGT

Asp718 918 : 5’ G|GTACC 3’ Reverse primer : ACTGTGTTAA (CCATG|G) AACGACAAAA

Amplifica-se o produto, a partir de DNA genómico extraído. Depois trata-se com as enzimas de restrição AfIll e Asp718, o vector e o produto de PCR. Mais uma vez, através de electroforese seleciona-se os fragmentos de clonagem bem sucedidos. Em seguida transmite-se o vector para E.Coli, e através do mecanismo de resistência a ampicilina isolam-se as E.Coli com o vector e usa-se as bactérias para copiar e aumentar a quantidade de vector. No final, temos um vector pcDNA 3.1 modificado, com um promotor de PSA em vez de CMV e com a sequência de GRZB, com um tamanho aproximado de 9kpb. Para testar a ideia, passa-se o vector para uma cultura de células humanas, de qualquer tipo (como controlo de específicidade), para uma cultura de células de tumor da próstata que expressem PSA e também para uma cultura de células do epitélio da próstata, uma vez que estas também expressam PSA. Seria necessário testar se a sequência de PSAP introduzida funciona e se os níveis de expressão são aceitáveis, se a sequência de GRZB é fielmente reproduzida, sem erros de splicing, e se apenas a expressão de GRZB nestas células é eficaz na indução da apoptose. Se a ideia mostrasse ser eficaz na eliminação de células tumorais, seria interessante adaptá-la para utilização num vector viral, como um lentivirus ou adenovirus. Este tipo de vectores permite uma distribuição mais “sistémica”, chegando a mais células, o que é particularmente interessante porque pode permitir a eliminação eficaz e precoce de metástases. A abordagem que seguimos é bastante “directa”, na medida em que se constroi o vector com estas características de uma vez e sem muitos testes. Na realidade, seria mais prudente e eficaz pegar nestes problemas de forma isolada e fazer vários testes e optimizações com recurso à construção de vários vectores recombinantes. Por exemplo, começar por construir um vector com expressão de GFP ligada ao PSAP, para ter a certeza que o PSAP funciona. Mais que isto, podia-se optimizar a sequência de PSAP, tendo em conta informação disponível na literatura e ferramentas de análise bioinformatica, tentar identificar de forma mais precisa o promotor e as suas estruturas cruciais, enhancers e outras sequências regulatórias, e através de engenharia genética sintetizar uma versão mais curta do promotor, incluindo e aproximando estruturas que se localizam em regiões mais distantes, ou até introduzir sequências originais que aumentem a eficácia (desde que isto não interfira com a topologia do processo), em vez de selecionar um pedaço a montante do gene sem grande critério como fizemos. Por outro lado, seria também prudente fazer vários ensaios com vectores indutíveis em células humanas, para ter a certeza que a sequência de GRZB usada era eficaz, se o splicing era eficiente e se no final, a activação deste mecanismo por si só, nas quantidades de expressão conseguidas com o vector, tinha uma capacidade satisfatória de induzir morte celular.

Trabalho realizado por: Ana Matos Diogo Amaral Gonçalo Correia Leonor Quintaneiro