User:Ana Matos/Notebook/Aulas de BioMolecular/2010/05/04

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Aula 7

Vectores


Os vectores de DNA permitem a replicação, transporte e/ou expressão de segmentos de DNA de interesse para células alvo. Os vectores mais frequentemente utilizados são vectores plasmídicos, moléculas de DNA circulares derivadas de sequências de DNA bacteriano extra-cromossómico e modificadas para incluir elementos genéticos de interesse.

1. Quais as características básicas que um vector plasmídico deve ter? Uma origem de replicação(ori), genes de resistência (normalmente a antibióticos como a ampicilina (amp)), um local de policlonagem (MCS), isto sempre com um promotor associado.

2. Os vectores podem ser representados pela sua sequência de DNA ou por mapas que incluem a indicação dos elementos mais relevantes presentes no vector.

Pesquise no google imagens dos vectores pUC, pGEX, pcDNA, pEGFP e o sistema pTre/pTet-On. Que diferentes características apresentam estes vectores e para que servem? pUC - Vector standart, possui apenas as características basicas. Usa-se em procariotas. pGEX - Permite fazer proteínas de fusão, encaixa-se o gene de forma a produzir uma proteína contígua com a GST o que permite depois separar o produto desejado muito mais facilmente, através da trombina. Usa-se em procariotas. pcDNA - Permite produzir mRNA em eucariotas, contém a mais a resistência à Neomicina, promotores de vírus de eucariotas (CMV, SV40) e sinal de poliadenilação. Assim é um vector para usar em eucariotas além de procariotas. pEGFP - Tem expressão da proteína GFP. Usado em procariotas e eucariotas. sistema pTRE/pTet-On - Tem um switch de expressão.

3. De que forma é que um vector plasmídico é mantido na célula alvo? As células alvo têm mecanismos de selecção natural e devido também a expressarem genes de resistência a antibióticos.

4. Para além de vectores de DNA simples como os plasmídeos, podem-se construir vectores mais complexos com base em vírus, facilitando a entrada das sequências desejadas nas células alvo. Entre estes, os vectores retrovirais são muito utilizados por permitirem a integração estável do DNA no genoma da célula alvo. Se tivesse que construir um destes vectores, como faria para garantir que não há perigo de infecção e doença? O virus tem que conseguir infectar as células de modo a que o seu genoma seja introduzido, mas não pode replicar-se. Mas note-se que se o gene se integrar num local que desrregule o ciclo celular podemos ter situações de cancro por exemplo, logo temos que ter em atenção o local de integração do gene.