User:Uriel E Barboza Perez/Notebook/Expresion intracelular e inclusion de la endoquitinasa ChiA74 en Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD1

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Expresión intracelular e inclusión de la endoquitinasa ChiA74 en Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD1

This project was done during a summer internship in the University of Guanajuato at Barboza Lab in 2013

  • Note : the following work and data is presented in spanish, an english version will be updated soon

Contents


Descripción del projecto/Abstract

Bacillus thuringienis (Bt) es el agente de control biológico más importante a nivel mundial debido a sus cristales insecticidas formados por proteínas Cry. Las quitinasas (Chi) pueden actuar sinérgicamente con Cry al degradar la membrana peritrófica y aumentar su efecto insecticida tóxico contra plagas de importancia agronómica y médica. Debido a que Chi son proteínas de secreción, tienen que ser precipitadas y posteriormente mezcladas con Cry. Este procedimiento puede ser evitado si las Chi son incluidas intracelularmente en forma de cuerpos de inclusión estables, ya que al esporular y lisarse la bacteria, tanto Cry como Chi y las esporas podría concentrarse por centrifugación (1). Recientemente, hiperexpresamos la endoquitinasa ChiA74 en Bt usando un promotor fuerte (pcytA) asociado a una región estabilizadora del mRNA pcytA/STAB-SD (2). En este trabajo nuestro objetivo fue transformar la cepa de Bt HD1 la cual se usa en la elaboración de varios bioisecticidas comerciales con una construcción que contiene chiA74 sin la región que codifica el péptido señal (chiA74Δsp) bajo el control del sistema pcytA/STAB-SD (chiA74Δsp-pcytA/STAB-SD). Los resultados son muy alentadores y confirman que la cepa recombinante expresa la ChiA74Δsp en forma de cuerpos de inclusión y aumenta considerablemente su actividad de endoquitinasa en comparación con la cepa silvestre.

Materiales y Métodos

Resultados y discusión

Transformación y selección de la cepa recombinante


(a) Bt se trasformó con plásmido pEBchiA74Δsp que contiene al chiA74 sin la región que codifica el péptido señal, bajo la regulación de un promotor de esporulación (pcytA) unido a una región estabilizadora del mRNA. (b) Varias transformantes fueron resembradas en agar nutritivo con eritromicina.


La cepa recombinante produce cuerpos de inclusión constituidos por ChiA74Δsp y forma cristales más pequeños

Al observar a contraste de fase (a) Bt HD-1 (cepa silvestre) produce cristales grandes bipiramidales (proteínas Cry1) (se indican con una flecha). (b) La cepatransformada (Bacillus thruingiensis HD1-pEBchiA74Δsp) produce cristales mas pequeños (marcado por una flecha). En uno de sus extremos se observa laacumulación de la endoquitinasa ChiA74Δsp (indicado con una flecha punteada), lo cual fue confirmado con una construcción quimérica entre la enzima y la proteína verde fluorescente (artículo en preparación). Lo anterior ocasionó que la acumulación de la endoquitinasa en el interior de Bt formara cristales mas pequeños, probablemente por competencia de metabolitos.


La cepa recombinante fue transformada con el gen chiA74Δsp

Confirmación por pCR
Carriles1 y 5, B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1; carriles 2 y 6, Bacillus thuringiensis-chiA74Δsp/STAB-SD; carriles 3 y 7, E. coli-chiA74Δsp/STAB-SD; carriles 4 y 8, vector pBluescript KS(+); L, Marcador de DNA de 1 Kb (New England Biolabs).
Carriles1 y 5, B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1; carriles 2 y 6, Bacillus thuringiensis-chiA74Δsp/STAB-SD; carriles 3 y 7, E. coli-chiA74Δsp/STAB-SD; carriles 4 y 8, vector pBluescript KS(+); L, Marcador de DNA de 1 Kb (New England Biolabs).



En los carriles 1 a 4 se usaron oligonucleótidos para detectar el gen que ocasiona la resistencia a la eritromicina. En los carriles 5 a 8 usaron oligonucleótidos para detectar el gen chiA74Δsp. La PCR demostró que la cepa recombinante contiene el gen de resistencia a eritromicina (carril 2) y el gen que codifica a la ChiA74Δsp (carril 6). La cepa silvestre carece de ambos genes (carriles 1, 5).
















Confirmación por geles de poliacrilamida y zimograma

(a)Patrón de proteínas. (b) Zimograma. Carril 1, B. Thuringiensissubsp. kurstaki HD-1; Carril 2, Bacillus thuringiensis-chiA74Δsp/ STAB-SD
(a)Patrón de proteínas. (b) Zimograma. Carril 1, B. Thuringiensissubsp. kurstaki HD-1; Carril 2, Bacillus thuringiensis-chiA74Δsp/ STAB-SD

En gel poliacrilamida se muestra que la cepa silvestre carece de la ChiA74Δsp (vera1), la cual se puede observar en la cepa recombinante (ver a2).En el zimograma se demuestra que la cepa recombinante tiene una proteína con actividad de endoquitinasa (ver b2), lo cual no se observa en la silvestre (ver b1).














La cepa recombinante tiene mayor actividad de endoquitinasa que la cepa silvestre

La mayor actividad de endoquitinasa en la cepa recombinante se debe a los cuerpos de inclusión formados por ChiA74Δsp

Conclusiones

  1. Se logró transformar Bt HD1 con el gen chiA74Δsp.
  2. Se formaron cuerpos de inclusión en el interior de HD1, lo cual incrementó la actividad de endoquitinasa en la cepa recombinante.
  3. Perspectiva : La cepa recombinante podría ser usada para mejorar las propiedades insecticidas de B. thuringiensis contra plagas de importancia Agrícola,ya que el principio activo lo formarían Cry, ChiA74Δsp y esporas.

Agradecimientos

Este trabajo se realizó durante una estancia en el verano del 2013 en el Laboratorio de Microbiología Molecular y Microbiotecnología de la Universidad de Guanajuato Campus Irapuato-Salamanca. El proyecto contó con el financiamiento del CONACYT,Ciencia Básica (proyecto 5569).


Referencias

  1. Hu SB, Liu P, Ding XZ, Yan L, Sun YJ, Zhang YM, Li WP, Xia LQ (2009) Efficient constitutive expression of chitinase in the mother cell of Bacillus thuringiensis and its potential to enhance the toxicity of Cry1Ac protoxin. Applied Microbiology and Biotechnology 82:1157–1167.
  2. Barboza-Corona JE, Ortiz-Rodríguez T, de la Fuente-Salcido N, Ibarra J, Bideshi DK, Salcedo-Hernández R (2009) Hyperproduction of chitinase influences crystal toxinsynthesis and sporulation of Bacillus thuringiensis. Antonie van Leeuwenhoek. 96(1): 31-42.

Notes

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