User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/05/11

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TP8

1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo.

Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.

Num humano teremos 2x1013 cópias e num litro de cultura existiram 3,5x1016.

2. Considere os seguintes vectores:


2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique.

O vector B pois é o que tem um promotor. Caso se usasse o vector A haveria a replicação do plasmídeo mas não a transcrição do gene que nos interessava.

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:

Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem:

Usaria as enzimas Bam HI e Eco RI para que o gene se pudesse inserir na zona de policlonagem, como na zona de policlonagem não há duas zonas de reconhecimento para a Eco RI o que tornas impossível a ligação dos fragmentos pois não há duas extremidades coesivas complementares.

3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.


3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Usaria a enzima de restrição Bam HI para "cortar" o vector e depois o fragmento poderia ligar se. No entanto não é possível garantir a expressão da proteina, por como o fragmento e o vector são "cortados" apenas por uma enzima não conseguimos assegurar que a extremidade que tem o codão de iniciação se liga ao lado correcto pois as duas extremidades do fragmento são iguais.

3.2 Como procederia para resolver o problema?

Após a replicação das bactérias na placa, isolaria um certo número de colónias em outras placas e depois usaria as enzimas de restrição Kpn I e Eco RI e depois faria uma electroforese para poder distinguir os fragemntos. Caso o fragmento estivesse bem isnerido teria dois fragmentos, um de 800pb e outro de 4500pb, se o fragmento estiver invertido terei dois fragmentos um de 120pb e outro de 5510pb, se não houver introdução do fragmento então terei apenas um fragmento de 4700pb.

3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não?

A clonagem funcionou pois na pista com a Eco RI e Kpn I temos dois fragmentos, um de aproximadamente 800 pb e outro de 4500pb o que indica que o fragmento foi bem inserido.

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