User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/04/27

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TP6 Exercício 1 – Extremidades e ligações Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT 1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? São palindrómicas, ou seja, a sequência complementar ao ler no sentido 3'-5' são iguais. 2. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. Bam HI :---G GATCC--- ---CCTAG G------- Hae II: ---GG CC------ ---CC GG------ Eco RI: -G AATTC--- -CTTAA G------- Bgl II: -A GATCT--- -TCTAG A------- 3. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? Sim EcoRI? Não BglII? Sim 4. Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. Maiores, uma vez que a a sequência que Hae II reconhece é menor que a do Bam HI. Assim a probabilidade de um GGCC ocorrer no genoma maior que um GGATCC, logo a enzima actua mais vezes fazendo fragmentos menores. Exercício 2 – Mapas de restrição As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. A que correspondem as bandas azuis no gel? As bandas azuis no gel correspondem a corantes de electroforese, o azul mais escuro permite ver a colocação da amostra nos poços e seguir o desenvolvimento da electroforese. Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? PleI BglI Esperados: | 4 | 3 | Observados:| 3 | 3 | Isto ocorre pois a resolução da electroforese não permite separar fragmentos que difiram por poucos pares de bases. Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? A concentração de agarose está relacionada com o tamanho da malha do gel de agarose, logo géis mais concentradas implicam uma malha mais apertada levando a uma separação mais eficiente de fragmentos com menor variabilidade no número de base Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo? Usando o marcador de pesos moleculares, faria uma recta de calibração em que poria o logaritmo do peso molecular dos fragmentos em função do tempo de retenção e depois com o tempo de retenção dos fragmentos digeridos conseguiria estimar o ser peso molecular. Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima. Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? Sim, pois a enzima ao cortar o bacteriófago λ em 5 locais formaria 6 fragmenotos, visiveis na electroforese. Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel? Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas? Bacteriófago λ DNA= 31.6*105 Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII: DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000 DNA x HindIII = 5500 + 4500 DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500 Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula. Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: uma enzima de corte único; uma enzima com dois cortes; uma enzima que não corta neste DNA. (ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA AAAAAAAAA)