User:Joana Vieira Fernandes/Notebook/Joana Fernandes/2010/03/23

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PCR e RT-PCR Introdução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.



Questões Que características deve ter um primer de PCR?

Cada um dos primers deve ser complementar a cada uma das nossas sequências, a partir do local onde queremos começar a replicação, no sentido 5' - 3'.


Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Primer especifico de gene - primer que contém uma sequência de DNA específica complementar à sequência que queremos replicar. Corresponde ao local na sequência de DNA onde queremos começar a replicação. Permite obter fragmentos de DNA especificos a partir do mRNA.

Primer Oligo- dT - primer para a sintese de cDNA. São primers que apenas se ligam à cauda de poly-A no mRNA (distinguindo-os dos restantes RNAs), local onde a transcriptase reversa se liga. Todos os cDNAs que utilizam estes primers contêm a terminação 3' do gene. Se o gene for demasiado longo, a enzima pode, por vezes, não conseguir chegar até à terminação 5', ficando o seu DNA desprovido dela. Isto pode ser crucial se o nosso local de interesse for perto desta terminação. Neste caso, este primer pode não ser o mais indicado. É um primer indicado quando se quer sintetizar cDNA provenientes de mRNA diferentes, cuja a única semelhança é a existência de caudas poly-A, no final de cada mRNA.

Primer random - primer de DNA de cadeia simples, que contém 6 a 8 nucleótidos colocados aleatoriamente em sequência e que não corresponde a nenhum local específico na sequência que queremos replicar. É um primer que pode ser utilizado para compensar a falhar do primer anterior, pois a criação de vários primers aleatórios permite-nos obter várias combinações, que podem corresponder à parte que queremos sequenciar. Existem vários tipos de RNA, entre eles, tRNA, mRNA, rRNA, etc, e sabendo que a quantidade de mRNA existente na célula é apenas 10%, este primer pode não ser o mais indicado pois vai gerar demasiadas cópias, das quais a maioria não são necessárias.


Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Podemos extrair DNA genómico dos membros da família a testar. Desenhamos dois pares de primers localizados, de modo a ser possível amplificar as sequências genómicas que devem conter as mutações, tendo em conta os locais das mesmas, conhecidos nos genes da mãe e do pai da Maria. Após a amplificação dos dois fragmentos delimitados pelos primers, estes são separados por electroforese em gel de agarose, purificados da agarose, e sequenciados para confirmar a presença da mutação. Como alternativa, após a amplificação de cada fragmento, podemos fazer um corte com uma enzima de restrição, caso o seu local de reconhecimento seja afectado pela mutação, impedindo o corte. Neste caso, estamos perante um método de diagnóstico por RFLP, em que o tamanho dos fragmentos de restrição obtidos na presença ou ausência de mutação serão diferentes.


Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Podemos extrair o RNA total das células que expressam a beta globina. Depois, fazemos um RT PCR para amplificar o RNA mensageiro da beta globina. Para isso, usamos dois primers específicos, localizados nas sequências 5’ e 3’ UTR, de forma a amplificar toda a região codante. Deste modo, podemos verificar se o gene da beta globina é expresso nessas células.


Nota: Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte: Protocolo Taq polimerase Protocolo Transcriptase reversa



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