User:Joana Vieira Fernandes/Notebook/Joana Fernandes/2010/03/16

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Entry title Sequenciação de DNA [edit] Introdução As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático. [edit] Questões O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? Cadeia molde (sentido 3' para 5'), primers, DNA polimerase, ddNTPs (didesoxirribonucleosídeos trifosfatados)em baixas concentrações, dNTPs (desoxirribonucleosídeos trifosfatados)em altas concentrações, marcadores de fluorescência (um para cada nucleótido). Que cadeia é sequenciada? A cadeia sequenciada é a cadeia que se inicia com o primer que adicionamos, sintetizada de novo de 5' para 3'. Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação? Porque esta técnica caracteriza-se pelo uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs) que, uma vez incorporados nas cadeias de DNA crescente, impedem a sua extensão pela DNA polimerase, pois não possuem o grupo 3’-OH. Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo? O método de sequenciação de Sanger é um método probabilistico. Em cada reacção, um ddNTP é incorporado aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando nesse caso a terminação da polimerização.O tamanho de cada fragmento é por isso determinado pela posição na cadeia filha na qual é incorporado o ddNTP. Para que isto aconteça, as proporções entre a quantidade de dNTPs e ddNTPs tem que estar bem reguladas, ou seja, os ddNTPs têm que estar em concentrações muito inferiores que os dNTPs. A densidade do sinal vai diminuindo à medida que a DNA polimerase vai avançando na sequência da cadeia filha. Isto acontece porque a enzima vai ser capaz de produzir menos quantidade de moléculas, quanto maior for o fragmento, já que menos fragmentos grandes são produzidos, logo, os picos que correspondem a fragmentos maiores são menores. Os picos que desaparecem podem estar relacionados com o esgotar de um dos ddNTPs na mistura. Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? Observa-se que a altura dos picos é cada vez menor, assim como a densidade do sinal. A DNA polimerase consegue produzir em maior quantidade e mais rapidamente fragmentos com um número de bases menor do que fragmentos com elevado número de bases, daí que a altura dos picos seja cada vez menor, à medida que a sequenciação decorre. A densidade do sinal também vai diminuindo à medida que o número de nucleótidos na sequência vai aumentando. Isto deve-se à capacidade de resolução dos fragmentos de DNA na electroforese, ou seja, a separação de fragmentos com número de bases muito pequeno ou muito grande é muito dificil, daí que apareçam no esquema picos sobrepostos. A resolução é dificil porque a separação dos diferentes fragmentos é de apenas um nucleótido. O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo? Devemos utilizar 2 primers separadamente, um que sequencia no sentido 5' - 3' e o outro no sentido contrário, de modo que consigamos cobrir a sequência completa. Devemos utilizar também diferentes primers em reacções de sequenciação diferentes, localizados em locais diferentes da cadeia a sequenciar, e espaçados de 60 - 800 bq cada, de forma a que as sequências obtidas sejam sobrepostas. Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo? Verde A; Azul C; Preto G; Vermelho T Individuo 1 : TCG TGT TCT ATG ATC ATG AGA GTC GCC G Individuo 2 : TCG TGT TCT ATG ATC/G (2 picos sobrepostos) ATG AGA GTC GCC G Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder? Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo? Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique. Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas. [edit] Para pensar Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações? O fragmento de DNA a sequenciar estava inserido num plasmídeo ou com uma sequência conhecida, ou então eram colocadas sequências conhecidas nas extremidades por ligação de adaptadores, aos quais depois se ligavam os primers. Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano? Utilizaram-se milhões de primers que permitiram ir entrando cada vez mais nas sequências dos cromossomas,e ir obtendo, cada vez mais, sequências sobrepostas que depois podiam ser ligadas umas às outras e produzir uma sequência contínua.