User:Ines Sofia Silva Vieira/Notebook/Bio Molec - caderno/2010/05/11

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TP8 [edit] Questões 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. Cópias de gene extraídas de uma pessoa: 2*10^13 cópias de plasmideo: 1000*5*10^9*700 = 35*10^14 2. Considere os seguintes vectores: 2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Escolheria um vector B uma vez que tem promotor o que permite a expressão genética e a transcrição de uma proteina humana. 2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem: Escolheria a segunda versão do fragmento de DNA da proteina pois as suas extremidades estão inseridas no local de policlonagem do vector e como são diferentes não há risco de o vector se fechar não integrando o gene. É também garantido que a sequência é inserida no sentido certo. 3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura. 3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? Introduziria a sequência no local de policlonagem na zona de BamHI. Como a sequência a introduzir possui as extremidades iguais, existe possibilidade da introdução ocorrer no local errado ou no sentido inverso ocorrendo uma troca na ligação às extremidades podendo mesmo o fragmento não ser inserido. 3.2 Como procederia para resolver o problema? A resoluçao do problerma poderia ser feita através da análise de vários vectores introduzidos na célula. Assim, para garantir que o fragmento é introduzido no sentido correcto, iremos proceder ao corte da sequência com a enzima KpnI e EcoRI e ver qual o tamanho do fragmento(procedendo por exemplo a uma electroforese). Os fragmentos obtidos têm assim tamanhos distintos permitindo-nos verificar se a sequência se encontra presente e se está no sentido que pretendemos. Se o fragmento tiver sido inserido no local correcto obtemos uma banda com 800pb e outra com 4500pb. Se o fragmento tiver sido inserido no sentido inverso as bandas têm 120pb e 5510pb enquanto que quando não há introdução do fragmento verifica-se apenas uma banda com 4700pb. Uma forma simples de resolução do problema para evitar a má inserção do vector por ter extremidades iguais, seria a adição de uma extremidade EcoRI ao fragmento. 3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido. Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? A clonagem funcionou pois na pista 3 conseguimos observar dois fragmentos, um de 800pb e outro de 4500pb. Pela resposta à questão 3.2, sabemos que estes são os fragmentos que comprovam uma inserção correcta.		)