User:Gaston Paris:Notebook/Clonado LOV

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Objetivo

Clonar el gen de Brucella abortus LOV en el vector pTrcHisB (Invitrogen) en sitios de restricción diferentes. Se considera el ORF anotado en genoma de B. abortus

Jueves 09/08/2007

Calle 1: BaLOVFullBam y FullLOV-ReverseXhoI,  Calle 2: BaLOVFullNhe y FullLOV-ReverseXhoI, Calle 3: BaLOVFullBam y StopLOVHind, Calle 4: BaLOVFullNhe y StopLOVHind,  Marker: Lambda Hind y PCR markers
Calle 1: BaLOVFullBam y FullLOV-ReverseXhoI, Calle 2: BaLOVFullNhe y FullLOV-ReverseXhoI, Calle 3: BaLOVFullBam y StopLOVHind, Calle 4: BaLOVFullNhe y StopLOVHind, Marker: Lambda Hind y PCR markers

PCR con oligos BaLOVFullBam, BaLOVFullNhe, FullLOV-ReverseXhoI y StopLOVHind. Como templado se utiliza gDNA de B. abortus 2308.

MIX X1 X4,5
gDNA 100ng/μl 1 μl 4,5 μl
TaqBuffer 10X 5 μl 22,5 μl
dNTPs 2mM 5 μl 22,5 μl
MgCl2 50 mM 1,5 μl 6,75 μl
Taq 5U/μl 1 μl --
H2O 34,5 μl 155,25 μl

La PCR se corrió en la cicladora genius con los siguientes ciclos:

5 min 94°C

35 ciclos de: 30 seg 94°C

1 min 55°C

1 min 72°C

final: 10 min 72°C


Viernes 10/08/2007

Precipitación de las PCRs

Se adicionaron 100 μl de agua cada tubo y se extrajeron con cloroformo.

El DNA se precipitó con isopropanol y se seco.


Lunes 13/08/2007

Digestión de las PCRs y el vector pTrcHisB para ligar.

Las PCRs se resuspenden en 14 μl de agua y se les adiciona 2 μl de NEBuffer 10X adecuado, 2 μl de BSA10X y 1 μl de cada una de las enzimas indicadas.

Tomé 5 μl del plásmido pTrcHisB (Qiagen) y las digerí en las mismas condiciones que las PCRs.

La digestión quedo toda la noche a 37°C

Miércoles 15/08/2007

Corrí un gel de agarosa con las digestiones y corté las bandas. La guardé a 4°C toda la noche.

Jueves 16/08/2007

Procesé los bloques de agarosa con el kit Illustra GFX (GE).

Calle 1: Bam-Xho, calle 2: Nhe-Xho, calle 3: Bam-Hind, calle 4: Nhe-Hind, marker: lambda Hind 1μg
Calle 1: Bam-Xho, calle 2: Nhe-Xho, calle 3: Bam-Hind, calle 4: Nhe-Hind, marker: lambda Hind 1μg

La banda superior corresponde a 2 μl del pTHB digerido con las enzimas que se indican en la leyenda y la banda inferior al fragmento de PCR con las mismas enzimas. - Cuantificación por el programa del documentador:

enzimas pTHB LOV
Bam-Xho 20 ng/μl 130 ng/μl
Nhe-Xho 10 ng/μl 200 ng/μl
Bam-Hind 20 ng/μl 100 ng/μl
Nhe-Hind 25 ng/μl 200 ng/μl

Guardo los tubos a -20°C hasta mañana


Miércoles 22/08/07

Bam-Xho Nhe-Xho Bam-Hind Nhe-Hind
pTHB vector 2 μl 3 μl 2 μl 2 μl
Inserto 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
Buffer Ligasa 10X 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
Ligasa 1/10 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
H2O 5 μl 4 μl 5 μl 5 μl

3hs a 16°C en baño de agua.

Miércoles 12/09/07

Transforme células competentes de DH5αF'Iq con 2,5 μL de la ligación del 22/08/07. Plaqueo 200 μl.

Jueves 13/09/07

Vinieron colonias en todas las placas. Colony PCR de 5 colonias de cada placa

Superior, calles 1 a 5: inserto NheI-HindIII clones 1 a 5; calles 6 a 10: inserto NheI-XhoI clones 1 a 5; calle 11: PCR marker 5 μl. Inferior, calles 1 a 5: inserto BamHI-HindIII clones 1 a 5; calles 6 a 10: inserto BamHI-XhoI clones 1 a 5; calle 11: PCR Marker 5 μl
Superior, calles 1 a 5: inserto NheI-HindIII clones 1 a 5; calles 6 a 10: inserto NheI-XhoI clones 1 a 5; calle 11: PCR marker 5 μl. Inferior, calles 1 a 5: inserto BamHI-HindIII clones 1 a 5; calles 6 a 10: inserto BamHI-XhoI clones 1 a 5; calle 11: PCR Marker 5 μl
MIX X1 X21
BALOV550 10μM 1 μl 21 μl
StopLOVHind 10μM 1 μl 21 μl
TaqBuffer 10X 2 μl 42 μl
dNTPs 2mM 2 μl 42 μl
MgCl2 50 mM 0,6 μl 12,6 μl
Taq Instituto 1 μl 21 μl
H2O 12,4 μl 260,4 μl

La reacción se incubó en Genius con el siguiente ciclado: 5 min a 94°C seguido de 35 ciclos de 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 72°C 1 min. Finalmente se agregaron 10 min a 72°C. 10 μl de cada reacción se corrieron en el gel de la derecha.

Se tomaron dos clones positivos para preparar las minipreps: N-H 1 y 2, N-X 1 y 3, B-H 1 y 2; B-X 2 y 4. Se crecieron en LB durante toda la noche.

Viernes 14/09/07

Calle 1: λHindIII 500 ng, calles 2 y 3: N-H 1 y 2, calles 4 y 5: N-X 1 y 3, calles 6 y 7: B-H 1 y 2, calles 8 y 9: B-X 2 y 4
Calle 1: λHindIII 500 ng, calles 2 y 3: N-H 1 y 2, calles 4 y 5: N-X 1 y 3, calles 6 y 7: B-H 1 y 2, calles 8 y 9: B-X 2 y 4

Minipreps con 6 ml de cultivo utilizando el kit QIAspin (QIAGEN). Luego de eluir con 50 μl de elution buffer se corrió 1 μl en un gel de agarosa para cuantificar.

Corrí 1 μl de cada ADN de la miniprep en un gel de agarosa. El resultado se muestra a la derecha. La cuantificación aproximada es de 100 ng/μl de cada muestra. N-H: pTrcHisLOV NheI-HindIII, N-X: pTrcHisLOV NheI-XhoI, B-H: pTrcHisLOV BamHI-HindIII, B-X: pTrcHisLOV BamHI-XhoI.

Mande a secuenciar las muestras N-H 1, N-X 1, B-H 1 y B-X 2, con los oligos FORpTrcHisA, REVpTrcHisA y BALOV550. Los resultados estarán para el miércoles 19/09.

Lunes 24/09/07

Analicé las secuencias que envíe y el resultado es el siguiente:

  • N-H 1: contiene una mutación que modifica un aminoácido. Enviar otro clon.
  • N-X 1: Está correcta en la zoma de lectura, faltan leer los extremos. Reenviar con oligos adecuados.
  • B-H 1: No salió la secuencia con el REVpTrcHisA. Reenvío con otro oligo y repetición secuencia REVpTrcHisA.
  • B-X 2: Tiene una base dudosa en la posición 590 aprox. Reenvío con oligo adecuado

Secuencias repetición:

  • B-H 1 con oligo LOV C69A Rev.
  • B-X 2 con oligo BaLOVFullBam.
  • N-X 1: con oligos LOV C69A Rev y REVpTrcHisA.
  • N-H 2: con oligos FORpTrcHisA, REVpTrcHisA, BALOV550 y LOV C69A Rev.

Jueves 27/09/07

Chequeo de la secuencia de los clonados:

BH1, OK

BX2, OK

NX1, falta secuencia entre 90 y 191 nt. Repetir con FORpTrcHisA.

NH2, falta secuencia entre 140 y 630 nt. Repetir con FORpTrcHisA y

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