User:Filipa Ribeiro C. Lucas/Notebook/Filipa Lucas/2010/05/11

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Questões

Manipulação do dna Insert (cdna ou pcr) Digere-se o vector e o insert e juntam-se os dois num tubo de ensaio. ligação entre as moleculas -> vector vazio.

Permite isolar os vectores recombinantes.


Clonagem com uma só enzima de restrição, poderá conduzir à entrada do gene invertido: há transcrição, pois os nucleotidos do gen não influenciam a transcrição, mas irá ser produzida uma proteina não funcional. Orientação das enzimas do fragmento de Dna têm que estar na mesma ordem , sendo esta a melhor opcção técnica.

1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias.


2. Considere os seguintes vectores:

2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique.

Vector B, com região do promotor (Queremos fazer clonagem, ou seja pretende-se que ocorra a transcrição do gene que se vai clonar no vector).

2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades:Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem



3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura.

3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína?

Clonagem: gerar apos a transformar crescer as bacterias de uma placa de petri com colonias que so descendem de uma bacteri. Probabilidade de gerar 3 combinações diferentes.

Factor 10 em individuos hemofilicos (usando leveduras). Local de policlonagem não é essencial a nivel de funcionalidade.


3.2 Como procederia para resolver o problema?


3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido.

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