User:Diogo Amaral/Notebook/Caderno BioMol/2010/04/27

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TP6 1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? Este tipo de segmento é chamado de um palíndromo de DNA, o que significa que ambos os filamentos têm a mesma seqüência de nucleotídeos mas em orientação de polaridade inversa. Enzimas de restrição diferentes cortam em seqüências palindrômicas diferentes. Às vezes os cortes são na mesma posição em cada um dos dois filamentos de polaridade inversa. Entretanto enzimas de restrição mais úteis fazem cortes que são desencontrados 1. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. Bam HI: G---GATCC 5' CCTAC---G 3' Hae II: GG---CC 5' CC---GG 3' Eco RI: G---AATTC 5' CTTAA---G 3' Bg III: A---GATCT 5' TCTAG---A 3' 1. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? Só com BamHi entre si, pois nos outros 2 casos as sequencias não são complementares! Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. Os fragmentos cortados com BamHi serão maiores pois ocorreram menos cortes já que uma sequencia de 6pbs aparece com menos frequencia que uma de 4 pbs. Exercicio 2 A que correspondem as bandas azuis no gel? Correspondem aos corantes da electroforese: azul claro são azul de xilene e azul escuro são azul de bromofenol. Servem como indicador em tempo real(sem ter que recorrer a luz UV) do deslocamento das bandas. Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? Espero 4 na lane do Plie I e 3 na lane do BglI. Consigo observar só 3 na enzima PlieI, porque 2 fragmentos tem o mesmo comprimento ou muito proximo e se sobrepoem na electroforese. Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? O tamanho dos poros varia inversamente com a concentração do gel. Quanto menos for o tamanho dos poros maior a resolução da electroforese, ou seja melhor separadas são as bandas. Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo? Fazendo uma recta com o logaritmo do tempo de retençao dos fragmentos e comparado com o tempo de retençao de um marcador de pesos molecualres podia achar o tamanho dos fragmentos. Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? Sim pois apresenta 6 fragmentos resultantes dos 5 cortes da enzima. Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel? A primeira e a última teem o mesmo numero de moleculas de dna, mas com tamanhos difrentes. Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas? 1ª Banda -> 440 ng 2ª Banda -> 73ng Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula. star>A EcoRI corta no nucleotido 500>A HindIII corta no nucleotido 5500>A EcoRI corte no 8000>end no 10000 Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: Uma enzima de corte único; BamHI Uma enzima com dois cortes DpnI uma enzima que não corta neste DNA: HindIII Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI Gene Normal: inicio-Xpbs-local1-175pbs-local2-201pbs-local3-Xpbs-fim Gene Mutado: inicio-Xpbs-local1-376pbs-local2-Xpbs-fim Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR Fazer um PCR com uma amostra de DNA, por um pool com a enzima Del e correr uma electroforese depois comparar a distancia percorrida pelos fragmentos para saber se houve ou nao corte da enzima no local 2. Sendo que os fragmentos maiores seriam positivos para a patologia. Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico). individuo saudavel: 3 bandas, que avançavam mais no gel individuo com mutaçao 2 bandas