User:Ana Matos/Notebook/Aulas de BioMolecular/2010/04/20
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Aula 5PCR e RT-PCR Introdução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. O meu objectivo neste procedimento será sequênciar o gene da beta-hemoglobina mutado para depois comparar com o gene normal, vendo assim as diferenças presentes (mutações). Procedimento experimental: 1. Design do par de primers que permitam a síntese da região do gene que é transcrita por PCR: a. LEFT primer: CATATTCTGGAGACGCAGGA b. RIGHT primer: TGCTCAAGGCCCTTCATAAT 2. Recolha da amostra biológica - esfregaço de células da mucosa bucal 3. Hidrólise ácida das células para obtenção do DNA 4. Preparar mix para PCR: a. Amostra de DNA b. 2 primers c. Taq polimerase d. dNTPs e. Solução tampão f. Água 5. Realizar PCR e fazer uma electroforese 6. Purificação do DNA, obtido no PCR, para eliminar as sequências correspondentes aos primers 7. Design dos primers que permitam a sequenciação da região do gene que contém as mutações: a. CATATTCTGGAGACGCAGGA (5’ → 3’) b. TGTACACATATTGACCAAATCAGG (5’ → 3’) c. ATGGGACGCTTGATGTTTTC (5’ → 3’) d. GGCATAAAAGTCAGGGCAGA (5’ → 3’) 8. Preparar mix para sequenciação: a. DNA template b. Primers c. DNA polimerase d. dNTP (A, T, C e G) e. ddNTP 9. Análise dos resultados – comparar os resultados da sequenciação com a sequência de referência (BLAST)
Para estudar a expressão do gene poderá recorrer-se à técnica de RT-PCR. Pela acção da enzima transcriptase reversa, a partir do mRNA, presente em cada indivíduo, obtém-se cDNA, que é estudado quantitativa e qualitativamente, comparando sequências obtidas com as sequências sem mutação. Procedimento experimental: 1. Design dos primers para a reacção de RT: b. RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC 2. Recolha da amostra biológica - sangue 3. Lise dos eritrócitos para obtenção do RNA (e sua preparação) 4. Preparar mix para reacção de RT: a. RNA desnaturado b. Solução tampão c. dNTPs d. MgCl2 e. Primers f. Transcriptase reversa g. Água 5. Design dos primers para a reacção de PCR: a. LEFT primer: TCTGTCCACTCCTGATGCTG b. RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC 6. Preparar mix para PCR: a. cDNA b. Solução tampão c. Taq polimerase d. 2 primers e. dNTPs f. Água 7. Realizar PCR e fazer uma electroforese 8. Análise dos resultados
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