User:Ana Matos/Notebook/Aulas de BioMolecular/2010/03/23

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Aula 4 PCR e RT-PCR Introdução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção. Questões Que características deve ter um primer de PCR?. O primer deve ser complementar da parte do DNA que queremos amplificar, deve hibridar com uma sequência se unica e conservada, o tamanho deve ser de médio pois muito pequeno pode haver muitas complementaridades e muito grande liga-se com demasiada "força", o primer deve ser estável a altas temperaturas e os primers não devem ser complementares. Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam? Específico do gene- Permite amplificar o RNA que queremos independentemente do tipo de RNA pois amplifica só essa parte, mas é necessário saber a sequência previamente Oligo-dT- servem para amplificar todo o mRNA pois a amplificação começa na cauda de poli-A, neste caso apenas permite a amplificação de mRNA e se o mRNA for muito longo a amplificação pode não ser completa e isso pode ser um problema se a parte que quizessemos analizar fosse a que não foi amplificada Random- serve para amplificar partes do RNA aleatórias, quando não sabemos ao certo onde está a parte que queremos amplificar e assim temos partes de diferentes tamanhos e sequências. Assim todo o RNA vai ser amplificado e vai ter diferentes tamanhos, temos posteriormente de "escolher" a parte especifica que queremos Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. [edit] Nota: Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte: Protocolo Taq polimerase Protocolo Transcriptase reversa