IGEM:Peking/2007/Switch:Miller

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Contents

Day 1

1. 检查要用的试剂是否量够:

  • D medium(一次活化、二次活化、稀释和空白对照要用);
  • Z buffer(配比时要用);
  • 氯仿、0.1%SDS(裂菌时要用);
  • 4mg/ml ONPG(反应物);
  • 1mM Na2CO3(终止反应要用)
  • 如果有不够的,赶紧配好,灭菌或滤菌;

2. 灭菌:短试管(不带试管帽);

  • Tube(离心用);
  • 锥形瓶(二次活化maybe会用到);
  • 带刻度试管(稀释时量取D medium用);
  • 枪头:大枪头(用的较多,多多益善啦),中枪头(用的不多,1-2盒吧),小枪头(诱导时可能会用到,当然超净台里应该会有的^__^)
  • 50ml塑料离心管(稀释时用到,根据实验需要看灭多少吧)

3. 挑MG1655划线扳子的单菌落到装有1ml D medium的试管中,一次活化摇菌过夜;

Day 2

1:100稀释到新的试管中,诱导组加IPTG(final concentration=1mM),二次活化摇菌到OD600=0.28—0.7(这次实验摇到了0.41,约4个半小时);如果二次活化体积过大,应选用100ml锥形瓶;(快诱导好的时候就可以准备要拿到王博那做实验的东西啦~)

4. 试管和做稀释用的50ml离心管放在冰中,使细菌停止生长;

5. 按所需比例用D medium稀释菌液;

6. 分光光度计测量稀释后的OD600,如过测量不准,则根据稀释倍数计算即可;

  • 拿着东西赶紧跑到生技楼王忆平老师实验室:

试管、tube、tube架(也可用王博那的)、菌液、1ml和200ml的微量移液器、大中枪头、试管架至少两个、timer、D medium(分装出一些配空白对照时用)、Z buffer、氯仿、01% SDS、4mg/ml ONPG、1mM Na2CO3。

7. 打开水浴,调节水温到28度,如果温度过高可用冰调节,取冰地点见下面提示;

8. 摆好试管,将菌液和Z buffer按照所需配比混合,每管总体积为2ml,空白组每种配比做两管,用D medium与Z buffer混合,;

9. 每管加入200ul氯仿和100ul 0.1% SDS,vertex 10s,28度水浴5min;

10. 每管加入400ul 4mg/ml ONPG,从加入第一管开始计时,每隔10s加入下一管,每加入一管立即vertex混匀,加下一管的同时将上一管放入28度水浴开始反应,开始反应时间为t0+10s;(t0可以事先就根据准备加入反应液的顺序写好的)

11. 待溶液出现足够的黄色,加入1ml Na2CO3终止反应,记录此时的时间t,反应时间即为[t-(t0+10)]s;

12. 将试管内的液体倒入tube,做好标记后,13000rpm离心3min,

13. 吸上清到事先洗好的比色杯中,测量OD550、OD420;

14. 按照公式 Unit=[(OD420-1.75*OD550)/t*v*OD600]*1000计算半β- 乳糖甘酶的活性单位。

王博那的分光光度计的使用方法

1:打开开关,在分光光度计背面;

2:等待机子启动完毕,出现下面页面:

  • Fixed
  • Scan

3:按向下移动键,选择Scan,按enter键,出现下面页面:

4:需要调节三项:

5:将比色杯放入样品槽,其中空白为右上角和1号样品槽,其他依次放入;(注意: 右上交的空白组光面朝自己,1-7号光面朝两侧,观察好光路不要放错。)

6:按Zero键,机子根据空白参比调零,到页面下方waiting字样消失即可;

7:按Run键,机子开始测量1-7号样品的OD550、OD420,并依次出现显示屏上,可等测量完毕,依从上行键依次记录结果;

8:第二批样品加入后,如未换空白组样品,则不需要重新调零,结果会从8-…显示,8号即为1号空白样品,依次类推,不要记错实验结果;

9:按Stop键停止反应,如不需要保存实验结果,不用按save results键,直接按Home键回到主页,取出比色杯,关掉电源即可;

10:比色杯用蒸馏水清洗干净,卫生纸上控干。

提示

1:生计楼地下一层有制冰机,可以去那里取冰以调节水浴温度;

2:水浴旁边要准备好vertex,调节到touch模式,方面实验操作;

3:反应时,可打开分光光度计开关,启动需要一段时间,启动完毕后调节响应选项;

4:离心的时候准备好比色杯;

5:测量之前,用擦镜纸将比色杯光面两测擦拭干净。

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