User:Ana Isabel F. Simoes/Notebook/Ana Simoes-biomol/2010/03/16
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TP3Sequenciação de DNAIntrodução
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.
O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? São necessários Primers, polDNA, os 4 dNTPs(A;T;C;G) e a cadeia de DNA codificante a replicar
Através da sequenciação conseguimos obter uma nova cadeia que vai ser igual à cadeia complementar (da cadeia molde).
Esta sequenciação é considerada por terminação devido à adição de didesoxirribonucleótidos que vão bloquear o crescimento do DNA em replicação.
A sequênciação não termina no primeiro nuclótido de cada tipo porque em cada fragmento o primeiro nucleótido pode não ser um didNTP e assim o crescimento da cadeia não é impedido.
Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? Existem alguns problemas aparentes. Em primeiro lugar é perceptivel uns picos de intensidade de fluorescência reduzida. Esta intensidade é reduzida quando temos fragmentos de grandes dimensões e a polimerase tem dificuldade em ligar-se a apenas um nucleótido (são formadas moléculas mais pequenas). Para além disto, temos picos mais largos devido a falhas na electroforese(diminuição da resolução) em que se torna dificil distinguir fragmentos de DNA de dimensão semelhante(começa a haver sobreposição dos mesmos).
O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo? Para analisarmos o fragmento completo poderíamos inicialmente sequenciar a primeira porção do nosso DNA e seguidamente proceder à elaboração de um primer correspondente à região terminal dessa sequência para desta forma por 'pedaços' conseguirmos obter a sequência completa.
Individuo 1: TCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCG Indivíduo 2: TCGTGTTCTATGATGATGAGAGTCGCCG
[edit] Para pensar Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?
Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano? Retrieved from "http://www.openwetware.org/wiki/BIOMOL_LCS/2010:TP_3"
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