IGEM:Peking/2007/Switch: PCR: Difference between revisions
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==聚合酶链式反应== | ==聚合酶链式反应== | ||
===酶的选取=== | ===酶的选取=== | ||
Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。 | Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。 | ||
Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 | |||
以上3种Taq酶都可以在产物末端加A，因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。 | Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 | ||
KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。 | |||
以上3种Taq酶都可以在产物末端加A，因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。 | |||
KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。 | |||
===PCR体系=== | ===PCR体系=== | ||
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。 | 一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。 | ||
===常用的Taq系列聚合酶反应体系=== | ===常用的Taq系列聚合酶反应体系=== | ||
克隆基因用 | 克隆基因用 | ||
Template 1uL | Template 1uL | ||
10×PCR buffer（Ex/LA） 5uL | 10×PCR buffer（Ex/LA） 5uL | ||
10×dNTP 5uL | 10×dNTP 5uL | ||
Primer-F 1uL | Primer-F 1uL | ||
Primer-R 1uL | Primer-R 1uL | ||
Ex/LA Taq 0.25uL | Ex/LA Taq 0.25uL | ||
ddH2O 36.75uL | ddH2O 36.75uL | ||
50uL system | 50uL system | ||
===菌落PCR检测用=== | ===菌落PCR检测用=== | ||
10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL | 10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL | ||
10×dNTP 1.5uL | 10×dNTP 1.5uL | ||
Primer-F 0.5uL | Primer-F 0.5uL | ||
Primer-R 0.5uL | Primer-R 0.5uL | ||
Ex/LA Taq 0.1uL | Ex/LA Taq 0.1uL | ||
ddH2O 11uL | ddH2O 11uL | ||
15uL system | 15uL system | ||
一般Taq系列聚合酶的反应条件为 | ===一般Taq系列聚合酶的反应条件为=== | ||
1．94℃ 5min Taq酶热激活 | 1．94℃ 5min Taq酶热激活 | ||
2．94℃ 30s DNA变性 | 2．94℃ 30s DNA变性 | ||
3．Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度，范围45～68℃，以60～68℃为宜 | 3．Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度，范围45～68℃，以60～68℃为宜 | ||
4. 72℃ ETs ET为延伸时间，1kb/min | 4. 72℃ ETs ET为延伸时间，1kb/min | ||
重复2～4，25个循环，增加循环数可以增大产物量，但是会引入更多突变。 | 重复2～4，25个循环，增加循环数可以增大产物量，但是会引入更多突变。 | ||
5. 72℃ 10min 在产物末端加A，不需要加A时可省去此步 | 5. 72℃ 10min 在产物末端加A，不需要加A时可省去此步 | ||
Revision as of 06:10, 18 October 2007
聚合酶链式反应
酶的选取
Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。
Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。
以上3种Taq酶都可以在产物末端加A，因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。
KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。
PCR体系
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。
常用的Taq系列聚合酶反应体系
克隆基因用
Template 1uL
10×PCR buffer（Ex/LA） 5uL
10×dNTP 5uL
Primer-F 1uL
Primer-R 1uL
Ex/LA Taq 0.25uL
ddH2O 36.75uL
50uL system
菌落PCR检测用
10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL
10×dNTP 1.5uL
Primer-F 0.5uL
Primer-R 0.5uL
Ex/LA Taq 0.1uL
ddH2O 11uL
15uL system
一般Taq系列聚合酶的反应条件为
1．94℃ 5min Taq酶热激活
2．94℃ 30s DNA变性
3．Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度，范围45～68℃，以60～68℃为宜
4. 72℃ ETs ET为延伸时间，1kb/min
重复2～4，25个循环，增加循环数可以增大产物量，但是会引入更多突变。
5. 72℃ 10min 在产物末端加A，不需要加A时可省去此步
