IGEM:Peking/2007/Switch: PCR: Difference between revisions
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聚合酶链式反应 | ==聚合酶链式反应== | ||
酶的选取 | ===酶的选取=== | ||
Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。 | Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。 | ||
Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 | Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 | ||
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KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。 | KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。 | ||
PCR体系 | ===PCR体系=== | ||
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。 | 一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。 | ||
常用的Taq系列聚合酶反应体系 | ===常用的Taq系列聚合酶反应体系=== | ||
克隆基因用 | 克隆基因用 | ||
Template 1uL | Template 1uL | ||
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50uL system | 50uL system | ||
菌落PCR检测用 | ===菌落PCR检测用=== | ||
10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL | 10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL | ||
10×dNTP 1.5uL | 10×dNTP 1.5uL | ||
Revision as of 06:08, 18 October 2007
聚合酶链式反应
酶的选取
Taq酶不具有3’->5’外切活性，保真度低，一般只作检测用，不用来克隆基因。 Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶，具有部分3’->5’外切活性，保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 以上3种Taq酶都可以在产物末端加A，因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。 KOD plus的延伸速度，保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性，KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus，只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。
PCR体系
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug（取决于靶序列含量），dNTP 200uM每种，引物50pmol每种，酶1U，缓冲液和水。模板可以是质粒，Lambda DNA，菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜，低特异性引物可长至30~35bp。
常用的Taq系列聚合酶反应体系
克隆基因用 Template 1uL 10×PCR buffer（Ex/LA） 5uL 10×dNTP 5uL Primer-F 1uL Primer-R 1uL Ex/LA Taq 0.25uL ddH2O 36.75uL 50uL system
菌落PCR检测用
10×PCR buffer（Ex/LA） 1.5uL 10×dNTP 1.5uL Primer-F 0.5uL Primer-R 0.5uL Ex/LA Taq 0.1uL ddH2O 11uL 15uL system
一般Taq系列聚合酶的反应条件为 1．94℃ 5min Taq酶热激活 2．94℃ 30s DNA变性 3．Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度，范围45～68℃，以60～68℃为宜 4. 72℃ ETs ET为延伸时间，1kb/min 重复2～4，25个循环，增加循环数可以增大产物量，但是会引入更多突变。 5. 72℃ 10min 在产物末端加A，不需要加A时可省去此步
