Etchevers:ChIP francais

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Contents

Overview

L'immunoprecipitation de la chromatine ou ChIP est une technique qui permet d'identifier les sites de liaison d'un facteur de transcription proteique sur l'ADN in situ. Base sur [1] et [2].

Materials

  • Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit d'Upstate, Catalog # 17-295
  • Préparation d’inhibiteurs de protéases Roche version MINI cat 04 693 159 : 25x = 0,42 ml eau par tablette (Version « complete EDTA-free » cat 04 693 132, c’est 2 ml par tablette)
  • tubes a microcentrifuge 1,5 ml
  • tubes a centrifuge 15 ml
  • sonicateur style Branson
  • potter ou mortier en agate et azote liquide
  • anticorps polyclonaux valides pour le ChIP y compris anti-histone H3 d'Abcam pour *temoin positif et anti-IgG pour temoin negatif
  • equipement d'electrophorese et agarose 1-2%
  • pipettes
  • gants
  • glace

Procedure

  1. Se procurer les tissus de souris. Prévoir 1 ml de fixateur par 100 mg de tissus dans un Falcon pré-pesé de 15 ml. Transférer les tissus avec PBS, centrifugation 1’ à 500g et enlever le surnageant avant de peser. Garder au froid et fixer aussitôt.
    1. 10 ml fixateur :
      • 9,33 ml PBS
      • 270 ul formaldéhyde 37%
      • (20 ul 0,5M EDTA)
  1. Fixer dans quelques ml pendant 10 ou 15 minutes à température ambiante avec rotation.
  2. Pendant ce temps, sortir le tampon « SDS Lysis Buffer » à température ambiante si on poursuit dans la foulée.
  3. Centrifugation 4ºC pour 30 secondes à 500g et/ou décanter fixateur immédiatement.
  4. Reprise dans 5-10 ml pour une concentration finale de 0,125M glycine :
    1. Pour 10 ml de solution arrêt :
      • 8,25 ml PBS
      • 100 ul Triton X100 à 10% (conserver stock au frais)
      • (PBS + Triton X100 = « PBT »)
    2. avec :
      • 1,25 ml glycine 1M
      • 400 ul inhibiteurs de protéases 25x
  1. Agiter doucement pendant 5 minutes pour arrêter la fixation.
  1. Centrifugation 4ºC pour 5 minutes à 500g. Décanter.
  1. Rincer avec PBT / 1x inhibiteurs de protéases sans glycine, toujours sur glace. Centrifugation et décantation.
  1. Enlever le surnageant autant que possible, reprendre les tissus dans 0,1 ml de SDS Lysis Buffer (tampon à faire à la main ainsi puisque le kit ne suffira pas en volume!).
    1. Pour 50 ml SDS Lysis Buffer :

##*2,5 ml de SDS 20% (1% final) ##*1 ml de EDTA 0,5M pH 8 (10 mM final) ##*2,5 ml de Tris 1 M pH 8.1 (50 mM final) ##*40 ml H2O ##*5 tablettes d’inhibiteurs de protéases Roche version MINI cat 04 693 159 (1 tablette si non version Mini)

    1. Vérifier pH à la fin pour pH 8.1 puis qsp 50 ml.
  1. Broyer en mortier agate avec de l’azote. Repartir le broyat pour l’équivalent de 5 mg tissu par tube Falcon de 15 ml, compléter chaque tube Falcon à 400 l avec du SDS Lysis Buffer :
  1. Garder 4 tubes pour une manipe puis congeler les autres à -30ºC ou -80ºC.


Notes

  1. Depend enormement sur la sonication - aucune mousse ni rechauffement toleree !
  2. Depend aussi de la fixation - a varier entre 10 et 15 minutes total (y compris centrifugation) en faisant moins pour les histones et plus pour les petits facteurs de transcription
  3. Le labo de Peggy Farnham a UC Davis a quelques indications
  4. Les sites de Upstate et de Chemicon a quelques astuces aussi
  5. Ne pas oublier de voir les confreres frustres aussi sur le forum de discussion de Protocol Online

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References

Relevant papers and books

  1. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, and Farnham PJ. . pmid:17140114. PubMed HubMed [OGeen2006]
  2. Elnitski L, Jin VX, Farnham PJ, and Jones SJ. . pmid:17053094. PubMed HubMed [Elnitski2006]
All Medline abstracts: PubMed HubMed

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  • Heather Etchevers
  • Jean-Claude Quintyn

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