Biotec 10. 박재형(JaeHyung Park)

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• 특수문자들
  

| • ∞ ♣ ♦ α β γ Δ ε η θ κ μ ν π ρ Σ τ φ ψ Ψ Ω ω
가장 앞에 있는 기호가 이미지 파일에 사용되는 구분용 특수 문자 입니다.

실험방법 회의

7. 20

• Spin coating

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:SolGel_SpinCoating.jpg

1. 용액을 사용한 박막형성법 중 가장 널리 쓰이고 중요함
2. 회전하는 기판에 용액을 떨어뜨리면 기판의 각속도에 의해 용액의 대부분이 제거되고 박막이 잔류하게 됨
3. 두께, 형상, 표면조직의 재현성이 높으나 제한된 범위의 제어(두께)만 가능하며 다양한 변화를 주기는 어려움
4. 공정변수로는 기판의 회전속도, 용액의 점도 및 휘발성, 확산도, 고분자의 분자량, 농도 등이 있으며 용액의 양, 증착 속도, 시간 등은 영향을 적게 미침
5. 과량의 용액은 기판의 회전 동작으로 제거되므로 소량(0.1ml)의 용액만으로도 막을 얻을 수 있다.

실험방법 회의

7. 20

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12274-013-0291-0

Paper Study

7. 16

Chemiluminescence biosensors for DNA detection using graphene oxide and a horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme

http://www.researchgate.net/publication/51876132_Chemiluminescence_biosensors_for_DNA_detection_using_graphene_oxide_and_a_horseradish_peroxidase-mimicking_DNAzyme link title

• Chemiluminescence DNA detection

1. Horseradish peroxidase (HRP)-mimicking DNAzyme (HMDNAzyme)은 G-quadruplex structure에 hemin이 삽입되어 구성됨
2. 과산화수소와 luminol을 사용하여 Chemiluminescence(CL)을 일으킴
3. HRP는 Protein peroxidase보다 DNA 서열이나 다른 타겟에 결합이 더 용이하며 그로인해 HMDNAzyme은 다양한 생체 분자의 비색 또는 CL 검출에 널리 적용 할 수있는 것을 의미
4. Graphene oxide (GO)는 흑연의 얇은 시트 형태이며 형광 반응을 소광하는 기능을 가짐
5. ssDNA와 GO는 서로 흡착되고 complementary target DNA 첨가 시 떨어짐
6. 따라서 CL의 강도는 ssDNA와 GO가 흡착되어 있을 때는 약하고 complementary target DNA가 첨가되어 ssDNA와 GO가 떨어졌을 때 강함

• Complementary target DNA(HT; target HIV sequence)와 GO 유무에 따른 관찰

• (a)는 P-HIV(HMDNAzyme)만 존재하고 HT,GO 없음
• (b)는 P-HIV와 10 nM HT 존재
• (c)는 PHIV + 10 nM HT + 0.32 μg mL^-1 GO
• (d)는 P-HIV + 0.32 μg mL^-1 GO
• (e)는 buffer solution
• Experimental conditions: P-HIV, 2 nM; luminol, 0.5 mM; H2O2, 30 mM

1. P-HIV가 단독으로 있거나 P-HIV와 HT만 존재할 때 가장 높은 CL 강도 나타냄
2. P-HIV와 GO만 있을 때는 원래 CL 강도의 94%정도 감소
3. P-HIV와 GO에 HT가 첨가 될 시에는 원래 CL강도의 46%정도까지 회복

• CL강도가 GO에 의해 소광되거나 GO의 흡착으로 인해 HMDNAzyme의 peroxidatic activity 떨어지는 것이 원인일 거라 추정
• 전자는 확인할 수가 없어서 peroxidatic activity를 관찰하기 위해 비색법을 사용

• P-HIV는 0.125 μM로 동일
• (a)는 GO가 없음
• (b)는 0.005mg mL^-1 GO
• (c)는 0.01mg mL^-1 GO
• 안쪽에 삽입된 그림은 ABTS를 사용한 비색법으로 흡광도를 관찰한 결과(λmax = 414 nm)

1. GO의 최소값인 0.32 μg mL^-1 으로 실험
2. HT의 농도를 달리하여 실험(0, 0.1, 0.2, 0.8, 1.2, 1.5, 2, 2.5, 3nM)
3. optimal condition으로 실험하여 I = 646.609C + 14.7161의 방정식을 얻음(R^2 = 0.9914)

1. HT와 MT(single-base mismatched target), NT(non-complementary target)로 나눠 CL강도를 비교함
2. HT에 비해 MT나 NT에서 CL강도가 낮음
3. 삽입 그림은 GO가 0.32 μg mL^-1 있을 때 HT,NT,MT를 비교
   1. (a)는 HT 존재, (b)는 MT 존재, (c)는 NT 존재, (d)는 HT,MT,NT 없음

• 장점

1. HMDNAzyme는 fluorescent probe보다 제조하기 용이하며 비용이 싸다
2. high sensitivity를 가지고 있어 34 pM target DNA도 검출 가능하여 더 복잡하고 정교한 실험을 하지 않아도 된다
3. single-base mismatched target도 구별 가능하여 특정 타겟 서열을 구별할 수도 있다

아이디어 회의

A Sequence‐Selective Electrochemical DNA Biosensor Based on HRP‐Labeled Probe for Colorectal Cancer DNA Detection

http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/00032710701746873#close
link title

• Crosslinking of Detection DNA with HRP

- A reaction mixture was prepared by mixing 100 μl of detection DNA (72.5 μmol l^-1), 100 μl of glutaraldehyde (2.5%) and 200 μl of HRP (10 mg ml^-1, pH 7.00), and the reaction lasted for 7 h at 4℃.
-Then 100 μl of L-Lysine (0.1%) was added to block for 3 h at 4℃. The reaction mixture was dialyzed overnight against 0.1 mol l^-1 phosphate buffer (pH 7.00) at 4℃ to remove the non-reacted low molecular reagents.

아이디어 회의

7. 8

1. 생체 내 염 농도 0.9%, 약 0.154M
2. Seewater 논문 NaCl 농도 0.001,0.5,3M

• (a)Biotin

1. Biotin은 avidin이라는 단백질에 높은 친화력을 가짐
2. Biotin과의 반응에 의해 수정된 dUTP를 사용(T자리에 dUTP가 들어감)
3. Biotin으로 표지된 탐침의 위치는 형광물질이 결합된 아비딘으로 차리하여 검정

• (b)Horseradish peroxidase(HRP)

1. Horseradish peroxidase and luminol

Horseradish pero×idase(HRP)는 luminol 을 분해하여 빛을 내게 함(chemiluminescence)

1. Glutaraldehyde 를 이용해 HRP를 ssDNA probe 에 결합시킨 뒤 이를 ssDNA에 처리하고 luminol을 넣어주면 혼성화 된 자리에서 luminol이 분해되며 발광함. 이는 일반사진 필름을 이용해서도 탐지할 수 있음

• Luminol

1. 화학식 C8H7N3O2, 분자량 177.16, 녹는점 319~320℃
2. 산화하면 화학발광, 즉 형광을 발생하는 특징이 있는 백색 결정
3. 이것을 사용하여 구리, 철 등의 검출이나 과산화수소(활성산소),시안이온을 정량할 수 있다
4. 또한 혈액(헤모글로빈이나 헤민)에 의해 예민하게 발광하기 때문에 혈흔 감식에 사용되고 있다.

1. 루미놀이 수산화 이온과 반응하면, 2가 음이온이 형성
2. 과산화수소에서 산소가 발생하고 루미놀 이온과 반응
3. 이 반응의 생성물인 유기 과산화물(organic peroxide)은 질소가 빠짐으로써 만들어지는데 매우 불안정한 상태
4. 전자가 이 때 들뜬 상태에 있다가 바닥 상태로 전이되며 에너지를 방출
5. 이 에너지의 방출이 파란색으로 보인다.

Paper Study

7. 6

Autonomous Nanomotor Based on CopperÀPlatinum Segmented Nanobattery

link title

1. 버블이 나오지 않아서 관찰이 용이함
2. TEM으로 Cu와 Pt 구분 가능
3. 구리의 길이로 속도 조절 가능

아이디어 회의

7. 4

1. 본체가 나노미터일 경우 닻을 DNA로 하면 크기의 차이가 너무 큼
2. 유기용매에서는 DNA가 용해되지 않음
3. 동력원: Pt,Mg, 전극을 이용한 nanobattery

7. 3

예비군 훈련

아이디어 관련 공부

7. 2

• Terminal tranferase

1. DNA homopolymer의 꼬리를 신장시키는 기능을 가지고 있음
2. 3'-OH에 deoxynuleotide triphosphate를 붙게하여 신장시킴
3. EcoRI과 같은 제한효소로 인해 생성된 sticky end를 신장시키는 것도 가능
4. 약 10~40개의 nucleotide를 추가함

아이디어 회의

7. 1

1. Si02와 Au를 이용한 모터
   1. linker에 DNA sheet를 부착하여 돛의 기능을 할 수 있을까?
2. track을 휘어지게 하거나 트랙을 나누어서 위아래로 트랙이 있을 경우 motor의 키가 커지게 하여 위쪽트랙과 아래쪽 트랙으로 모터가 이동할 수 있을까?

아이디어 회의

6. 30

1. DNA 17mer을 이용하여 세로구조로 키(높이)가 변하며 이동하는 모터
2. 네가닥의 발로 회전하며 이동하는 모터

Paper Study

6. 29

A Synthetic DNA Walker for Molecular Transport

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja047543j#close
link title

• DNA Sequences for the Walker System

1. walker와 track strands, attachment strands 서열들
2. walker에는 소광제 존재하며 track에는 형광제가 있음

• Schematic of walker locomotion

1. walker의 1번 다리(W1)가 attachment strand(A1)에 의해 track strand(T1)에 결합
2. 마찬가지로 A2로 인해 W2가 T2와 결합
3. detachment fuel strands(D1)에 의해 D1과 A1이 결합함으로써 W1과 T1사이의 결합이 풀림
4. 위와 같은 cycle로 반복됨

• Non-denaturing polyacrylamide gel analysis & Multiplexed real-time fluorescence monitoring

1. 전기영동의 밴드를 통해 결합 유무 확인
2. Multiplexed real-time fluorescence monitoring을 통해 각 단계의 형광 반응을 확인
3. 예를 들어 W1과 T1의 결합 시 소광제로 인해 T1의 형광 반응이 감소 -> D1의 첨가로 인해 결합이 해제되면 다시 T1의 형광반응 증가

Paper Study

6. 25

A Precisely Controlled DNA Biped Walking Device

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl049527q#close
link title

• Cartoon of the biped system with DNA base sequence included

1. DNA로 이루어진 DNA Biped Walking Device와 Track
2. DNA Biped Walking Device는 느슨한 Linker(DNA)로 연결됨
3. Foot 부분(F1,F2)과 트랙의 Foothold 부분은 single strand로 이루어짐
4. Foot 부분(F1,F2)의 끝에는 Psoralen groups이 존재
5. Foot과 Foothold를 연결하기 위해 set strands(SS1A,SS2B)를 사용

• Cartoon depiction of biped system taking a full step

1. Foot과 Foothold를 연결하는 set strand를 떼어내기 위해 unset strand를 사용
2. set strand 떨어져 나가면 발은 자유로워짐
3. 다음 foothold와 연결하기 위해 set strand를 넣어주면 다음 foothold와 foot이 결합하여 전진
4. 뒤쪽의 foot도 마찬가지의 시스템으로 이동

• Shows a detailed picture of a foot strand (tan), a set strand (black), and a foothold strand (blue)

1. psoralen에 UV를 조사할 시 set strand,foothold strand에 연결이 이루어 질 수 있음
2. set strand,foothold strand에 있는 T에 psoralen이 결합 가능
3. foot strand,set strand,foothold strand가 모두 결합한 형태가 (b), 실패하고 두가지만 붙은 것이 (c)와 (d)

• Record of a biped walk

1. psoralen의 결합(3 component complexes)를 통한 walking의 확인
2. set strand가 부착 시 foot 끝 부분의 psoralen에 UV를 조사하면 3 component complexes가 일어나게 됨
3. 3 component complexes의 형성을 관찰하여 움직임을 확인

Paper Study

6. 24

A Single DNA Molecule Nanomotor

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl015713+#close
link title

• Structure and operation of a Single DNA Molecule Nanomotor

1. Motor는 17mer DNA nanomotor (T1G2G3T4T5G6G7T8G9T10G11G12T13T14G15G16T17)로 구성됨
2. 17mer DNA nanomotor는 tetraplex (TE) 형태로 바뀔 수 있음
3. 17mer DNA nanomotor의 양쪽 끝부분에는 형광제와 소광제가 있음
4. 17mer DNA와 상보적인 strand α가 주입될 시 17mer DNA가 팽창하여 duplex (DU)형태로 바뀜
5. strand α는 strand β가 주입되면 strand α와 결합하여 Motor에서 떨어져 나감, 다시 원래 형태(TE)로 바뀜
6. 이러한 시스템이 순환

• Fluorescent response of the nanomotor 17mer (red) and the S17mer (green)

1. S17mer는 nanomotor 17mer와 유사한 비교군
2. K+는 G-rich sequence를 loose random coil로부터 compact TE 형태로 변환
3. (I)는 기본상태 (II)는 K+첨가 (III)는 complementary sequences 첨가
4. K+를 첨가하면 compact TE로 변환되기 때문에 형광반응이 감소
5. complementary sequences 첨가 시 DU상태가 되므로 형광반응 증가

• Cycling of the DNA nanomotor

1. nanomotor가 순환됨에 따른 형광반응을 측정

Paper Study

6. 23

An Autonomous DNA Nanomotor Powered by a DNA Enzyme

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.200453779/abstract#close
link title

• Structure and operation of an autonomous DNA nanomotor

1. E,F 두 가닥으로 구성된 모터
2. E strand에는 RNA-cleaving10-23 DNA enzyme가 있음
3. F strand는 두 가지의 fluorophores가 존재함
4. The enzyme substrate(S)는 DNA–RNA chimera임
5. E strand가 수축상태(close)에서 S가 결합함으로써 팽창상태(open)가 됨
6. S는 RNA-cleaving10-23 DNA enzyme으로 인해 절단됨
7. S는 절단되어 S1,S2로 나뉘어졌다가 E strand에서 떨어져 나감
8. 이러한 원리로 open/close 시스템이 순환
9. 이 때 F strand의 fluorophores가 반응함

• Native gel electrophoretic analysis of DNA motor formation

1. 전기영동으로 Motor의 형태 확인
2. S`는 S와 유사하지만 절단되지 않음
3. S가 Motor와 결합한 뒤 S1,S2로 절단됨을 확인

• The autonomous cycling of the DNA motor & Fluorescence spectra of the DNA motor in the closed and open states

1. Motor과 S는 1:20의 비율로 첨가
2. 20개의 S가 30분에 모두 분해됨, 1개당 1.5분의 시간 걸림
3. Open/Close의 순환 시스템을 형광반응을 통해 확인

Paper Study

2. 24 (Tue)

Self-assembled DNA nanostructures for distance-dependent multivalent ligand–protein binding

http://www.nature.com/nnano/journal/v3/n7/abs/nnano.2008.164.html#close
link title

• Aptamer

Aptamers are oligonucleotide or peptide molecules that bind to a specific target molecule.

• Aptamer의 거리,helix 수에 따른 결합 효율

1. aptamer 거리가 5.3nm일 때 최적
2. four-helix bundle(4HB)가 5HB보다 결합이 높음

• Aptamer의 종류에 따른 효율

1. 서로다른 Aptamer일 때가 동일한 aptamer일 때보다 효율이 높음

• Aptamer의 거리를 통한 실험결과

Aptamer의 거리가 5.8nm,20.7nm 인 두가지로 실험을 진행했을 때 5.8nm인 부분에 Thrombin이 결합

※즉 선택적인 결합이 가능

Paper Study

2. 17 (Tue)

Single-molecule chemical reactions on DNA origami

http://www.nature.com/nnano/journal/v5/n3/full/nnano.2010.5.html#close
link title

• Linker A,B,C

1. non-cleavable linker type A
2. linker type B, which contains a disulphide moiety that can be cleaved by reduction
3. Linker C can be cleaved by singlet oxygen generated with light in the presence of a singlet oxygen photosensitizer (PS)

• three functional groups

1. The reaction of biotin-linked azide Az took place in the presence of the in situ generated copper(I)-THTA (tris-(1-[3-hydroxypropyl]triazolyl-4-methyl)amine) catalyst
2. The reaction of the biotin NHS-ester Es was performed in a slightly alkaline buffer/DMF mixture
3. The reaction of the biotin-linked alkyne Al was studied in the presence of the in situ generated copper(I)-THTA in a DMF/buffer mixture

• The three reactions can proceed successively on the immobilized DNA origami template with high selectivity.

Team presentation

2. 12 (Thu)

Nucleic acid enzymes

Box file name : 150212_Team3-nucleic acid enzymes.pptx

• PCR

DNA,RNA의 특정영역을 대량으로 증폭하는 기술.

-Primer가 taq polymerase에 의해 신장됨.

Denaturation - Annealing - Elongation 의 과정을 반복하여 수행.

-이론적으로 n사이클 시행 시 2^n개의 ds DNA 생성.

mRNA를 cDNA로 역전사하는 reverse transcriptase를 이용하는 RT-PCR도 있음.

• Restriction Enzyme

ds DNA의 특정 염기서열을 인식하여 그 부분이나 그 주변을 절단하는 효소.

바이러스 등 외부에서 온 DNA를 절단하여 배제시키는 자기방어 기능도 가짐.

Restriction Enzyme에 의해 절단되는 모양에 따라 Blunt end,Sticky end로 나뉨

• Ligation

DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정

Restriction Enzyme과 함께 쓰이는 경우가 많음.

Ligase에 의해 phosphodiester bond로 DNA 분자 내에서 일어나는 한가닥 파손(불연속)을 복구.

• Gene Cloning

1. PCR을 통해 foreign DNA을 생성하고
2. 같은 Restriction Enzyme으로 vector와 foreign DNA을 절단한 뒤
3. foreign DNA을 vector에 삽입하여 Ligation시켜 결합함.
4. 만들어진 recombinant DNA를 bacteria 내부로 trasformation 시키면
5. cell 내에서 증식이 일어나고 셀 자체도 많은 colony를 이루게 됨.

Paper Study

2. 10 (Tue)

Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery

http://www.nature.com/nnano/journal/v7/n6/abs/nnano.2012.73.html#close
link title

• siRNA(small interfering RNAs)

이중가닥의 RNA(double-stranded RNA)가 Dicer에 의해 절단되어 생성되는 21에서 25nt 크기의 작은 RNA조각

상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제

siRNA 가 mRNA와 100% 상보적인 경우는 mRNA 를 분해하고, 약 80-90% 상보적인 경우는 번역을 억제

• self-assembly of the DNA tetrahedron

cell 내로 siRNA 전달 가능

크기를 정의할 수 있어야한다.

높이는 8nm, 모서리 길이는 10nm

리간드가 적절한 공간배향에 있을 때 gene silencing이 이뤄진다.

• 전달 효율

siRNA의 circulation time (t1/2 ≈ 6 min), ONPs의 circulation time (t1/2 ≈ 24.2 min)

ONPs가 only siRNA일 때보다 세포 내로 siRNA의 전달이 더 원활하게 이뤄진다.

Team presentation

2. 5 (Thu)

Gel electrophoresis

Box file name : Team3_150205_gel-eletrophoresis.pptx

• Gel electrophoresis

1. (-)charge를 띤 입자가 gel을 통해 (+)방향으로 이동
2. 이동속도는 입자의 전하량,크기,구조에 따라 달라짐.

• Agarose gel electrophoresis

1. DNA,RNA를 electrophoresis 할 때 주로 사용
2. 핵산이 가지고 있는 전하를 이용하여 agarose gel상에서 크기,구조에 따라 분리
3. electrophoresis 후 EtBr 처리하고 UV를 통해 Band 관찰

• SDS-PAGE

1. Protein을 electrophoresis 할 때 주로 사용
2. Protein은 전하, 구조가 일정치 않으므로 sds와 dtt를 처리하여 변성시킴
3. Polyacrylamide gel은 disc gel로 stacking gel과 running gel로 이루어짐
4. Gly와 Cl에 의해 protein이 stacking gel에서 일직선상에 정렬되고 running gel에서 size에 의한 분리가 일어남
5. electrophoresis 후 Coomassie Brilliant Blue로 염색하고 Band 관찰
6. Marker를 통해 size의 비교. -(agarose gel electrophoresis도 동일)
7. 분리능을 높이기 위해 Two-dimentinal electrophoresis 또는 Western blot 하기도 함

caDNAno

2. 1 (Sun)

Paper Study

2. 1 (Sun)

Precision Templating with DNA of a Virus-like Particle with Peptide Nanostructures

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja4008003#close Box file name : Ruff2013J_Am_Chem_Soc(jae hyung park).pdf
link title

• 정확한 길이의 빌딩블록을 자가조립하는 것은 쉽지않다.

섬유형 바이러스의 모양을 모방하여 정밀하게 길이를 제어할 수 있다.

• 인공 capsomer를 만든다.

인공 capsomer의 양전하 부분에 주형 DNA가 결합하여 섬유형 바이러스 같은 형태를 만든다.

주형 DNA에 의해서 길이를 정밀하게 control할 수 있다.

• 정확한 길이의 초분자의 활용

특정 크기의 물질을 적재하거나 더 복잡한 구조의 template, building block을 만들 수 있다.

정확한 크기의 초분자를 만들 수 있음으로서 새로운 물질을 디자인하는데 쓰일 수 있다.

caDNAno

1. 22 (Thu)

Paper Study

1. 20 (Tue)

End-joining long nucleic acid polymers - STV

http://nar.oxfordjournals.org/content/36/16/e104.short#close Box file name : Van_den_Hout2008Nucleic_Acids_Res(Jaehyung Park).pdf, PJH150120_stv.pptx
link title

• Ligation

DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정 single-strand, long-nucleic acid일 경우 효율이 떨어지는 단점

• Biotin–streptavidin linkage

streptavidin은 단백질의 일종 biotin은 비타민의 일종으로 강한 결합력으로 결합함.
강한 결합력을 이용해 end-joining을 하는 방법.
2-step으로 이루어짐 한분자에 stv를 붙이고(1-step)
unbound stv를 제거한 다음 두번째 분자를 붙임(2-step)

• Gel electrophoresis

전극을 이용하여 물질을 이동시키며 크기나 구조에 따라 이동속도의 차이가 일어남.
크기를 분석하는 방법.

• The application of Biotin–streptavidin linkage

single-strand를 필요로 하는 실험에 쓰임.
강한 결합력을 이용하여 병원성 박테리아의 선택적 포획 등에도 쓰임.

Paper Study

1. 3 (Sat)

Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns - DNA origami

http://www.nature.com/nature/journal/v440/n7082/full/nature04586.html#close Box file name : Nature04586(PJH).pdf, PJH150103_dna origami.pptx
link title

• DNA Structure

1. DNA is double helix structure.
2. In DNA, there are four different types of nitrogenous base.
   According to base pairing rules (A with T and C with G), hydrogen bonds bind the nitrogenous bases of the two separate polynucleotide strands to make double-stranded DNA.
   • A is for adenine
   • G is for guanine
   • C is for cytosine
   • T is for thymine

• DNA origami

1. DNA origami is the nanoscale folding of DNA to create arbitrary two- and three-dimensional shapes at the nanoscale.
2. A long single strand DNA and staple DNA strand are required
   • The use of a long single strand DNA in M13mp18.
   • Staple DNA strand folded long single strand DNA.
   • Use a computer to determine the way to create the correct staples needed to form a certain shape. And we create arbitrary two- and three-dimensional shapes at the nanoscale.

• The application of DNA origami

1. DNA origami will enable making small computer.
2. DNA origami be used to create nanorobots capable of finding and destroying cancer cells in the human body.

• Consideration

DNA origami was very impressive and DNA origami technology development will continue.
So DNA origami can be adapted to create more complex or larger structures.