Biomod/2013/Sendai/experiment

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Revision as of 21:24, 18 October 2013 by Kazuki Hirahara (talk | contribs)
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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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<section role="main">
       <article>

<h2>Experiment</h2> 1 Step1 温度感受性リポソームの破壊<br> 1-1温度感受性リポソームを破壊する実験<br> 2 Step2 DNAによる連鎖的リポソームの破壊<br> 2-1 DNAオリガミによるアプローチ<br> 2-1-1 デザインしたDNAオリガミの作製<br> 2-2-2 DNAオリガミに蛍光付きDNAがハイブリしていることの確認実験<br> 2-1-3DNAオリガミによりリポソームを破壊する実験<br> 2-1-4 DNAによる配列特異性を証明する実験<br> 2-2 フラワーミセルによるアプローチ<br> 2-2-1 DNAオリガミによりリポソームを破壊する実験<br> 2-2-2 DNAによる配列特異性を証明する実験<br>

<h3>1 Step1 温度感受性リポソームの破壊</h3> <h4>1-1温度感受性リポソームを破壊する実験</h4> <h6>Purpose</h6> 私たちのプロジェクトでは外部刺激を感知するイニシエーターの一例としてニッパム修飾したリポソーム（温度感受性リポソーム）を使用する。そのため、温度上昇によりニッパム修飾のリポソームが割れること実験により確認する。<br>

In our project, liposome collapses by temperature shift is a crucial step. Thus, we should confirm the temperature sensitivity of PNIPAM lipids-based liposome.（訳途中）<br>

<h6>Method</h6> 脂質にはEggPC、バッファーには？？を使用し、ボルテックス法によりリポソームを作製した。 リポソームにNIPAM (in クロロホルム)を質量比？？？の割合で加えた。 スライドガラスを作製し、位相差顕微鏡でリポソームがあることを確認した。 リポソームが確認できたら、スライドガラスの上にお湯を乗せて温度を上げた。 Protocol （対応するプロトコルへのリンク）

<h6>Result</h6> 温度を上げる前のリポソームの状態は図１のようになった。

図１　温度を上げる前のニッパム付きのリポソーム

スライドガラスにお湯を乗せて温度を上昇させた後のリポソームの様子は以下図２、図３のようになった。観察しているリポソームは図１のものと同じである。まず、図２のようにバックグラウンドがザラザラになって、しばらくすると図３のようにリポソームが確認できなくなった。ピントを調節してもリポソームは確認できなかった。

<h6>Discussion</h6> 図１で見えていたリポソームが、図２，３のように消えてしまったのでニッパム付きのリポソームが割れたと考えられる。しかし、リポソームによっては温度を上げた後も残っているものがいくつか確認できた。これはリポソームがマルチラメラ（脂質二重膜が複数重なっているもの）になっているものと考えられ、脂質二重膜が単一層のユニラメラよりも割れにくいからだと考えられる。上記図１，２，３で定点観察したリポソームはユニラメラであると考えられる。

<h3>2 Step2 DNAによる連鎖的リポソームの破壊</h5> <h4>2-1 DNAオリガミによるアプローチ</h4> <h5>2-1-1 デザインしたDNAオリガミの作製</h5> <h6>Purpose</h6> In our project, we used DNA origami as triggers for collapsing liposomes. We designed a rectangular DNA origami with a chipped edge and tried to make it.<br>

<h6>Method</h6> We mixed M13mp18, staples, 5xTAE Mg2+, and mQ in a microtube and annealed it for 2.5 hours.<br> <A href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai/protocol">Protocol</A><br> <br>

<h6>Result</h6> We confirmed that our DNA origami was well formed by AFM (Atomic Force Microscope) (Fig.1).<br> <Img Src="http://openwetware.org/images/d/d9/Outsideafm2.png"> <br> Fig.1 AFM image of DNA origami (M13: 4nM, staples:20nM)<br> <br>

<h6>Discussion</h6> Just like our design, rectanglar origamis with chipped edges were observed.

<h5>2-1-2 DNAオリガミに蛍光付きDNAがハイブリしていることの確認実験</h5> <h6>Purpose</h6> If the origami is fluorescently labeled, it is much easier to observe the effect of DNA origami on liposomes. So we labeled our origami by hybridizing it with fluorescent tagged DNA strands.<br><br>

<h6>Method</h6> Our DNA origami has many staples that can bind to fluorescent tagged DNAs for labeling. We mixed fluorescent tagged DNAs together with DNA origami staples in annealing solution.<br> In addition, to see if the origami binds to the fluorescent tagged DNA in shorter time, we added the fluorescent tagged DNA into control annealing solution, which contained no fluorescent tagged DNA, and left it for 40 minutes.<br> To see the origami was well labeled with fluorescent molecules, we used electrophoresis. <br> Electrophoresis was conducted with a 1% agarose gel, CV100V for 50 minutes.<br> <A href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai/protocol">Protocol</A><br> <br> By scanning a gel before staining, we can see only the bands of DNA structures with fluorescent molecules; scanning a gel after staining, we can see the bands of all DNA structures. So we scanned a gel before and after staining (we scanned both a non-stained and a stained gel). <br> First we saw the bands of our origami in a non-stained gel. Then, we compared the bands with those in a stained gel. If the bands of origami in a non-stained gel were at the same height as those in a stained gel, we can say that our origami is successfully fluorescently labeled.<br> <br>

<h6>Result</h6> In a non-stained gel (Fig.2), only bands in lane 3 and 4 from the left (*Ori, **Ori) can be seen. They are fluorescent labeled structures. In addition, as they gave the same result, 40 minutes is long enough for fluorescent labeling.<br> <Img Src="http://openwetware.org/images/5/58/S_Outside-gel-3.2.png" width="300"><br> Fig.2 Non-stained gel image: only bands in two lanes can be seen. From the left, they are DNA origami with fluorescent molecules in pre-annealing (Ori*), and DNA origami with fluorescent molecules in post-annealing (Ori**)<br> <br> In a stained gel (Fig.3), marker (lane 1) had the longest DNA strand of 20kb. Comparing this and M13mp18 (lane 2) with annealed DNA origamis (lane 3,4,5), the bands of the origamis are at the higher position. Therefore, we concluded that in lane3~5, DNA origami structure made of M13 and staples were made as we had expected. <br> We considered that the bands in lane3~5 are seen as if they were diffused, just because our origami has many staples binding to the fluorescent tagged DNAs, and each origami attaches to different number of them, and its molecular weight varies.<br> <Img Src="http://openwetware.org/images/2/2d/S_Outside-gel-2.2.png" width="300"> </br> Fig.3 Stained gel image: from the left, marker, M13mp18, Ori*, Ori**, and DNA origami with no fluorescent molecule (Ori)<br> <br>

<h6>Discussion</h6> Combining the results of Fig.2 and 3, the fluorescent labeled bands in lane3 and 4 in Fig.2 are at the same height as those of DNA origami in Fig.3. Thus, we concluded our origami was successfully fluorescently labeled.<br> <br>

<h5>2-1-3 DNAオリガミによりリポソームを破壊する実験</h5> <h6>Purpose</h6> DNAオリガミのハイブリによってリポソームが割れるのかどうかを確かめる

<h6>Method</h6> DNAオリガミに蛍光をハイブリさせたものをアニーリングにより作製する 膜染色（テキサスレッド）したリポソームをつくる リポソームのみを蛍光顕微鏡で観察する。 リポソームにDNAオリガミを加えてその後の様子を観察する

Protocol （対応するプロトコルへのリンク）

<h6>Result</h6>

<h6>Discussion</h6>

<h5>2-1-4 DNAによる配列特異性を証明する実験</h5> <h6>Purpose</h6> このプロジェクトにおいてリポソームをDNAで割る理由は、DNAの配列特異性を利用して割れるリポソーム間に関係性を持たせるためである。そこで配列の異なる２種類のDNAを生やしたリポソームを用意して片方だけに相補なDNAを加え、２種類のリポソームのうちDNAが相補になっている片方のリポソームだけが破壊されることを確かめた。

<h6>Method</h6> 内部にGFPを含んだリポソームとテキサスレッドで膜を染色した２種類のリポソームを作製する。GFPを含んだリポソームには～～～の配列を持つコレステロール付きのDNAを膜染色をしたリポソームには～～～の配列をもつコレステロール付きのDNAを振り掛けた。各リポソームを生成してリポソームにくっつかなかったコレステロール付きのDNAを除去して、２種類のリポソームが入っている溶液（サンプル）を混合して （対応するプロトコルへのリンク）

<h6>Result</h6>

<h6>Discussion</h6>

<h4>2-2 フラワーミセルによるアプローチ</h4> <h5>2-2-1 DNAオリガミによりリポソームを破壊する実験</h5> <h6>Purpose</h6> DNAオリガミのハイブリによってリポソームが割れるのかどうかを確かめる。

<h6>Method</h6> DNAオリガミに蛍光をハイブリさせたものをアニーリングにより作製する 膜染色（テキサスレッド）したリポソームをつくる リポソームのみを蛍光顕微鏡で観察する。 リポソームにDNAオリガミを加えてその後の様子を観察する （対応するプロトコルへのリンク）

<h6>Result</h6>

<h6>Discussion</h6>

<h5>2-2-2 DNAによる配列特異性を証明する実験</h5> <h6>Purpose</h6>

<h6>Method</h6> （対応するプロトコルへのリンク）

<h6>Result</h6>

<h6>Discussion</h6> 


       </article>



   </section>

<!-- /***** </div> ****/ --> 


   <footer>
       <p>&copy; Copyright Biomod 2013 Team Sendai
               <a href="http://www.molbot.mech.tohoku.ac.jp/index.html">

　　　　　　　　　　　　　　　　　　<img src="http://openwetware.org/images/3/36/Murata-nomura-logo.png" 

                                     width="180" height="50" alt="Molcular Robotics Lab" border="0" align="right">

　　　　　　　　 </a> 　　　　 </p> 

       <p>E-MAIL:
           <a href="mailto:biomod.teamsendai.2012@gmail.com">biomod.teamsendai.2012@gmail.com
           </a>
       </p>
       <br>
       <a href="?action=edit" align="center"><p>edit</p></a>
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