Biomod/2013/Sendai/experiment

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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   <section id="tabs">
     <article data-title="Experiment">
           <h2>Experiment</h2>

<p> <h3>About</h3></br>

    </article>
   
     <article data-title="アルギン酸">

<h3 id="experimentsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3></br>

<h4>1-1リポソームの作製とそれをバッファーに入れてアルギン酸ゲルビーズ内に入れる実験</h4></br>

アルギン酸膜内部のリポソームが割れて、リポソームの中に入っていたキレート剤がアルギン酸膜を破壊するというシステムを実現するためにはアルギン酸ゲルビーズ内にリポソームを入れる必要がある。そのために、まずリポソームを作製し、それをアルギン酸ナトリウム水溶液に入れて、アルギン酸ゲルビーズを作製する実験を行った。</br> リン脂質一重膜で覆われたドロップレットが油と水の界面に形成されたリン脂質一重膜を通過させることでリン脂質二重膜ベシクルを作製した。</br> グルコース100μℓにoil70μℓを加えてouterバッファーを作製した。次に、oil40μℓにBSG（？）（蛍光物質）を1μℓ加えて、ピペッティングとタッピングで白く濁るまで混ぜて、innerバッファーを作製した。そのinnerバッファーをouterバッファーの上に注いで70秒遠心にかけて、リポソームを作製した。</br> 遠心した後、チューブの底にたまったベシクルを取り出し、1.5% アルギン酸ナトリウムに加え、それをキャピラリー中に入れ、400mM 塩化カルシウム 140μL中に滴下してFig1のような装置で２～３分遠心した。</br>

    Fig1 アルギン酸ゲルビーズの作製</br></br>

リポソーム内に蛍光タンパク質が入っているためリポソームが光る。作製したアルギン酸ゲルビーズを共焦点レーザー顕微鏡で観察すると、アルギン酸ゲルビーズ内に光る円状のものが確認されたので、アルギン酸ゲルビーズの中にリポソームが入っていることが確認された。</br></br>

<img src="http://openwetware.org/images/c/cc/Image0032.jpg"></br></br>
    Fig2 アルギン酸ナトリウム水溶液に蛍光入りリポソームを加えて作ったアルギン酸ゲルビーズの共焦点レーザー顕微鏡画像</br></br>

<h4>1-2内部にバッファーの入ったアルギン酸膜の作製</h4></br>

アルギン酸ゲルビーズの中は粘度が高く、ＤＮＡの衝突回数が減るためアニーリングができない。そこで、内部にバッファーを含んでいて、外側がアルギン酸ゲルになっているアルギン酸膜を作製する必要がある。このアルギン酸膜を作製するために、二重ノズルを作製して以下の実験を行った。</br>

２重の毛細管に遠心機で高重力をかけることによりあらかじめ封入された内容液と外溶液（アルギン酸ナトリウム溶液）がノズル先端から内容液がアルギン酸ナトリウムに包まれた状態で粒状に放出される。これを塩化カルシウム溶液に滴下することで表面のみがゲル化して、膜状のゲルビーズが完成する。</br>

Fig3のように外側の太いキャピラリーと内側の細いキャピラリーを作成する。キャピラリーは外径1mmのものを熱加工した。</br> </br> 外管には1.5%アルギン酸ナトリウム溶液を、内管には蛍光物質+mQをいれた</br>

２重キャピラリーを用いて2～3分遠心にかけ0.4M塩化カルシウム水溶液に滴下する。</br>

    Fig3 二重ノズルの構造</br></br>

完成したアルギン酸ゲルを共焦点レーザー顕微鏡で観察すると、下図のようにアルギン酸ゲルの内部に蛍光が確認できた。このことから内部にバッファーを含むアルギン酸膜が作製できたことが分かった。</br>

<h4>2ニッパムの効果でリポソームが割れることの確認実験</h4></br>

このプロジェクトでは温度を約３２度に上げた時に確実にニッパムの効果でリポソームが割れる必要があるため、温度を約３２度に上げればニッパム付きリポソームが割れることを確認した。</br>

ニッパム分子は３２度以下では水和していて親水性だが、３２度以上では収縮して疎水性になる。ニッパムがリポソームに修飾されると、３２度以下ではニッパム分子の水和により安定な状態になるが、３２度以上ではニッパム分子が疎水性になって不安定な状態になるので、３２度以上になった時にリポソームが割れることになる。</br>

参考</br> http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf</br></br>

PNIPAM付き脂質を使ってＧＵＶによりニッパム修飾されたリポソームを作製した。</br> PNIPAM付き脂質とはFig2のような、リン脂質にPNIPAMが結合したものである。</br>

    Fig4 PNIPAM付き脂質（サンプル）</br></br>

※W/Oエマルション法を用いたGUV(Giant Unilamellar Vesicle)</br></br>

10mM DOPCのストック溶液をArガスで乾燥させた脂質フィルムをミクロチューブ内に作り真空デシケータ内でさらに乾燥させた。リン脂質フィルムに流動パラフィン 500μLを加える。超音波洗浄機を用いて60℃で60分間リン脂質をオイルに溶かした。インナー溶液を150mM スクロース、350mM グルコース、100mM EGTAとする。オイルに溶かしたリン脂質にインナー溶液 50μLを加え、遠心分離し、エマルション溶液を作製した。アウター溶液を600mM グルコースとする。アウター溶液 100μLにエマルション溶液 70μLを加える。</br></br>

参考</br> Thermoresponsive Nanostructures by Self-Assembly of a Poly(N-isopropylacrylamide)−Lipid Conjugate Daniel N. T. Hay ,† Paul G. Rickert ,‡ Sönke Seifert ,§ and Millicent A. Firestone *† J. Am. Chem. Soc., 2004, 126 (8), pp 2290–229　Publication Date (Web): February 3, 2004</br></br>

リポソームを作製したら、位相差顕微鏡でリポソームの数を数えた。そして、温度を約３２度に上げて再び位相差顕微鏡でリポソームの数を数えた。（結果を表で示す）</br> その結果、温度を上げた後の方がリポソームの数が減っていたのでニッパム分子の効果でリポソームが割れたと考えられる。</br></br>

<h4>3アルギン酸ゲルビーズを溶かすのに必要なＥＧＴＡの濃度と時間の測定</h4></br>

アルギン酸膜内のリポソームの中にはアルギン酸ゲルを溶かすのに十分なＥＧＴＡ（キレート剤の一つ）が入っている必要がある。また、ニッパムの効果でリポソームが割れた時に尿素アニーリングとアルギン酸膜の破壊が同時に起こるが、前者にかかる時間よりも後者にかかる時間の方が短くなければならない。そのため、アルギン酸ゲルビーズを溶かすのに必要なＥＧＴＡの濃度と時間を測定した。</br>

アルギン酸ゲルビーズを作製し、50mM,100mM,500mMのＥＧＴＡを加えたものとＥＧＴＡを加えないものを用意する。このＥＧＴＡの濃度が違う４種類のアルギン酸ゲルビーズが時間とともにどれくらい減るのかを測定する。それぞれ０分後、５分後、１０分後…のサンプルを取り出してアルギン酸ゲルビーズの数を数える。同じ実験を何回か行った。（測定結果、平均値などをまとめた表を書く。）</br></br>

以上の結果からアルギン酸ゲルビーズをとかすのに必要なＥＧＴＡ濃度は？mMで、それにかかる時間は約？分だと分かった。</br></br>

<h4>4尿素アニーリングによるＤＮＡオリガミの作製とその作製にかかる時間の測定</h4></br> 尿素アニーリングによりトリガーとなるＤＮＡオリガミがきちんと形成される必要がある。また前述したとおり、このシステム（アルギン酸班のシステム）の実現には尿素アニーリングにかかる時間がアルギン酸膜が破壊される時間よりも短くなくてはならないため、尿素アニーリングにかかる時間を測定した。</br>

尿素アニーリングの原理は以下のとおりである。</br> 尿素があることで水分子の極性が小さくなる。DNAのハイブリダイゼーションは水素結合によって行われるので、尿素により水素結合の力が小さくなる。これにより、通常より低い温度でも融解が可能になる。これを応用したものが尿素アニーリングであり、徐々に尿素の濃度を下げることでDNAをハイブリダイゼーションさせることができ、通常の融解温度より低い温度でのアニーリング可能となる。</br>

M13pm18(7249nt)と226個のステプルを100μℓの12.5mMの酢酸マグネシウム入りの10×TAEの中に入れ、95℃から20℃に１℃/分でアニーリングしたものとM13pm18と226個のステイプルを300μℓの12.5ｍMの酢酸マグネシウムと85%のホルムアルデヒド入りの10×TAEの中に入れ、透析装置で0.2mℓ/分の割合で次第にホルムアルデヒドの濃度を薄くしていったものとをAFMや電気泳動で調べた。</br>

ＡＦＭで設計したサイズ・形の構造体が確認され、電気泳動でＭ１３のレーンと尿素アニーリングしたＤＮＡオリガミを泳動したレーンのバンドを比較すると後者の方が前者よりも高い位置にバンドが確認されたため、オリガミの構造体ができていると思われる</br></br>

    Fig5 尿素アニーリングにより作製したDNAオリガミのAFM画像（サンプル）</br></br>

<h4>5温度を上げればアルギン酸膜が破壊されることの確認</h4></br>

2と3の実験が成功したのでこれらを組み合わせて、温度を上げて内部にキレート剤であるリポソームが割れれば、アルギン酸膜が割れるかどうかを調べるために以下のような実験を行った。</br> まず、アルギン酸ゲルビーズを作製して位相差顕微鏡で30μℓ当たりのアルギン酸ゲルビーズの数を数えた。</br> 次に、割れた後に系全体のＥＧＴＡの濃度が実験3で調べた最適な濃度になるような量のＥＧＴＡを入れたリポソームを作製した。これをアルギン酸ゲルビーズの入っている溶液の中に入れて温度を約３２度に上げた。その後、位相差顕微鏡で30μℓ当たりのアルギン酸ゲルビーズの数を数えた。（結果を表で示す）</br> ＥＧＴＡ付きリポソームをいれて温度を上げた後の方がアルギン酸膜の数が減っていたので、温度を上げることでニッパム付きのリポソームが破壊されて、キレート剤であるＥＧＴＡが放出されてアルギン酸膜が破壊されたと考えられる。</br></br>

<h4>6アルギン酸膜内で尿素アニーリングができていることの確認</h4></br>

1と4の実験が成功したのでこれらを組み合わせて、アルギン酸膜内で尿素アニーリングができるかどうかを調べるために以下のような実験を行った。</br> 二重ノズルの外管に1.5%アルギン酸ナトリウム溶液を、内管に尿素とＤＮＡオリガミの材料を入れてアルギン酸膜を作製した。時間をおいてキレート剤を加えて、アルギン酸膜を破壊した。溶液をとってＡＦＭで確認した。（ＡＦＭの画像）</br> 設計したとおりのＤＮＡオリガミが観察されたのでアルギン酸膜内で尿素アニーリングができたと考えられる。</br></br>

<h4>7全体のシステムの機能確認</h4></br>

5と6の実験が成功したのでこれらを組み合わせて、我々が目指しているシステム全体が機能しているかどうかを調べた。</br> まず、内部に尿素と、ＤＮＡオリガミの材料と、キレート剤であるＥＧＴＡを入れたニッパム付きリポソームを作製する。次に、二重ノズルを使ってアルギン酸膜を作製する。位相差顕微鏡でアルギン酸膜の数を数える。温度を約３２度に上げる。もう一度アルギン酸膜の数を位相差顕微鏡で数えた。また、同じ溶液をＡＦＭで観察した。</br> 温度を３２度に上げる前と後で、アルギン酸膜の数は減少してその溶液からＤＮＡオリガミがＡＦＭで観察できたので、私たちの目指しているシステムが機能していると考えられる。</br>

     </article>

     <article data-title="リポソーム">

<h3 id="experimentsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </h3> <p>反応を開始するトリガーDNAが放出され、反応が開始されると、次にすべきは反応の連鎖である。有効成分と、新たなトリガーを含んだリポソームを破壊すれば、放出された構造物が、連鎖反応的に周囲のリポソームを破壊する。</br> 反応の連鎖は、リポソームの作成・トリガー及び内部構造体の作成・そのトリガーを実際に作用させる、という三段階に分けられる。</br></p>

<p><h4>・リポソームの作成</h4> まず、released trigger DNAにより、割られるリポソームを作成する。</br> </br> リポソームを作るリン脂質は、両親媒性であり(親水基hydrophilic group・疎水基hydrophobic groupを持つ)、水と接触すると、親水基が内部に水を取り込み内側を、疎水基が外側を向くように整列する。こうして球状のリポソームが作成できる。</br> </br> 脂質(DOPC)、脂質を溶かす溶媒(CHCl3)、TR-DHPEをミクロチューブにいれ、Arガスで乾かした。次に、観察用Bufferを加えたのち、湯煎してリポソームを作成した。リポソームは蛍光顕微鏡で観察した。</br> </br> <Img Src="http://openwetware.org/images/c/cf/Fig1_liposome.png"> <Img Src="http://openwetware.org/images/1/1c/Fig2_liposome.png"></br> Fig.1,2 separated, uni-lamella liposomes observed by a fluorescent microscopy</br> 蛍光顕微鏡で、数個のリポソームが観察された(Fig.1,2)。リポソームは、赤く膜のみが染色されており、個々に分かれたユニラメラリポソームが作成できた。</br> </p>

<p><h5>・一本鎖DNAをはやしたリポソームの作成</h5> 次に、作成したリポソームをDNAをトリガーとして割るには、トリガーDNAをリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションさせる必要がある。そこで、リポソームにコレステロール修飾DNAを添加し、表面に一本鎖DNAが現れるようにする。これを、トリガーDNA構造体の一部と相補的な配列を持つ一本鎖DNAとすれば、トリガーDNAがリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションする。ここでは、割る前に、一本鎖DNAをはやしたリポソームを生成する。</br> </br> まず、ミクロチューブにDOPC、CHCl3を99μℓ加え、この溶液を乾燥させた。ここに観察用バッファーを入れ、整置水和した。</br> リポソームにコレステロール修飾したDNAをつけるため、作製したリポソームにcholesterol修飾DNAを加えた。</br> (上手く観察できなかったので、お盆明けに再度実験します)</p> </br>

<p><h4>・リポソームを破壊するトリガーであるDNAオリガミの作成</h4> DNA origamiは、あらかじめ決まった構造体を作る際に用いられる構造である。DNA origamiは足場配列（scaffold strand）という一本鎖の長鎖DNAとステイプル配列（staple strand）という短い一本鎖DNAで構成される。</br> </br> 私たちのプロジェクトでは、リポソームを破壊するトリガーとしてDNA origamiを利用する。このDNAオリガミは、標識のための蛍光基付きDNAが付くことのできるステイプルをもっている。</br> 私たちは、電気泳動により、トリガーDNAオリガミの作成と、その蛍光修飾(蛍光基つきDNAが、DNAオリガミに確かに接着していること)を確かめようとした。</br> </br> 染色前にゲルスキャンを行うと、蛍光基のついたストランドのみが観察されるので、蛍光修飾された構造体の位置を確認することができる。次に、染色後、ゲルスキャンを行うと、全てのDNA構造体の位置が確認できる。これらを合わせて、まず、染色後にDNAオリガミが正しく作られたことを確かめ、さらに、それが染色前にみられた蛍光修飾された構造体の位置とほぼ等しく、DNAオリガミがうまく蛍光修飾されたことを確かめた。</br> </br> マイクロチューブにM13mp18, ステイプル, 5xTAE Mg2+, mQ,　蛍光基付きDNAを混合、2時間半アニーリングを行った。</br> 対照実験として、蛍光基付きDNAの代わりに,mQを入れた、蛍光修飾なしDNAオリガミも作成した。</br> </br> 蛍光基付きDNAがDNAオリガミに接着するのに、より早い時間でもすむかを調べるため、アニーリング後、蛍光修飾なしDNAオリガミ溶液を10μlとり、同様の蛍光基付きDNA0.6µlを加え、40分間放置した(これを、蛍光後付け修飾DNAオリガミとした)。</br> </br> 電気泳動は、１%アガロースゲルを用い、CV100Vで50分行った。</br> <Img Src="http://openwetware.org/images/6/64/Fig3_gel.png" align="left"> Fig.3 染色後のゲル画像。左から：ラダー、M13、蛍光付きDNAオリガミ(Ori*)、蛍光後付けDNAオリガミ(Ori**)、蛍光なしDNAオリガミ(Ori)</br> </br> 染色後のゲル画像(Fig.3)の、ラダー(レーン1)の最大のDNA鎖は20kbである。これとレーン2のM13とを、アニーリングしたDNAオリガミ(レーン3，4，5)たちと比べると、DNAオリガミたちのほうが、上部にバンドが見られる。よって、レーン3~5において、M13とステイプルが反応した構造体が出来たことがわかった。なお、バンドが拡散してしまったので、バンドの高さは、バンドの真ん中で比較した。<br clear="left"> </br> </br> <Img Src="http://openwetware.org/images/8/8e/Fig4_gel.png" align="left"> Fig.4 染色前のゲル画像。左から、蛍光付きDNAオリガミ(Ori*)と、蛍光後付けDNAオリガミ(Ori**)のみが観察できる。</br> 次に、染色前のゲル画像(Fig.4)をみると、レーン3,4にのみ、蛍光修飾された構造体が確認できた。これらは、染色後のゲル画像(Fig.3)でみられたDNAオリガミと等しい位置にある。よって、DNAオリガミが無事蛍光修飾されたと言える。<br clear="left">

       </article>

       <article data-title="B-Z">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3><br> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4><br>

私たちの実験はリポソームを作製する実験、リポソームにコレステロール修飾DNA及びループDNAを結合させる実験、トリガーDNAを作用させリポソームを割る実験の３つがある。</br>

<h5>1.リポソームの作成</h5> 基本的には上記のリポソーム班と同じ方法で作成した。</br> ここでは相分離リポソームの作り方について説明する。</br></br> まずDOPC,DPPC,CholesterolそれぞれのLipidを製作する。</br> DOPCを7.8mg.,DPPCを7.3mg, Cholesterolを3.8mg　それぞれとCHCl3を1mlをミクロチューブにいれ、60℃のお湯の中で1時間超音波（43KHz）にかける。</br> それぞれ10nMolのDOPC,DPPC,Cholesterol　 Lipidができる</br> 次にDOPC:DPPC:Cholesterol=10:10:4の割合で混合し相分離リポソームを製作する。</br> DOPC(10nM)を4μℓ、DPPC(10nM) を4μℓ、 Cholesterol (10nM)を1.6μℓ、buffer</br></br>

次に、ミクロチューブに100μℓ観察用Bufferを入れ、３時間ほど湯煎した。</br> 箱からミクロチューブを取り出しそこから30μℓとり蛍光顕微鏡で観察した。</br> 蛍光顕微鏡で、リポソームが観察された</br></br>

<h5>2.コレステロール修飾DNA及びループDNAの結合</h5> フラワーミセルを形成するためにループ構造のＤＮＡをリポソーム表面に結合させなければならない。そのため、まずコレステロール付きのＤＮＡをリポソームに１で製作したリポソームにコレステロール修飾DNAを付ける</br> 通常のリポソーム、相分離リポソームの二種類で行う。</br>

</br> <table>

<tr> 
 <td> 
  完成したリポソーム0.1mM 　
 </td>
 <td>
  0.5μℓ
 </td>
</tr>
<tr>
 <td>
  Chol leg 0.1μM
 </td>
 <td> 　
  0.2μℓ
 </td> 
</tr>

</table> </br>

次にコレステロール修飾DNAに相補なループDNAを加える</br> ループDNAは10bp,20bp,40bpの三種類、リポソームが二種類の計6パターンのサンプルで実験を行う。</br>

</br> <table>

<tr> 
 <td> 
  DNA付リポソーム　0.1mM　
 </td>
 <td>
  0.5μℓ
 </td>
</tr>
<tr>
 <td>
  ループDNA        0.1μM　
 </td>
 <td> 　
  1.0μℓ
 </td> 
</tr>

</table> </br>

確認はＡＦＭを用いる。</br> AFMを用いて、DNA付リポソームを観察したところ、リポソーム表面にDNA鎖のようなループを確認することができた。</br>

<h5>3.DNAループにトリガーストランドのハイブリ</h5></br> トリガーストランドを加える前にリポソームの数を数えた</br> DNAループができた六種類のリポソームにトリガーストランドを注入しリポソームを割る</br>

</br> <table>

<tr> 
 <td> 
  ループ付きリポソーム　0.1mM
 </td>
 <td>
  0.5μℓ
 </td>
</tr>
<tr>
 <td>
  トリガーDNA　　      1.0mM　
 </td>
 <td> 　
  0.2μℓ
 </td> 
</tr>

</table> </br>

投入後30分間常温で放置し　蛍光顕微鏡で観察する</br></br>

トリガーストランド投入前には観察することができたリポソームが、投入後は確認することができなかった。つまりリポソームが予測どうり割れたと考えられる。</br></br> 　

      </article>

   </section>

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       </p>
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