Biomod/2013/Sendai/design

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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   <section id="tabs">
     <article data-title="Design">
           <h2>Design</h2>

<h3>全体のプロジェクト</h3> 私たちは、制御された薬の放出系を行うために膜構造を破壊してその反応が連鎖していくシステムを構築する。そしてこのシステムの実現のためには以下の２つが必要である。 ①好きなタイミングで反応の連鎖を開始できるように、内部にリポソーム膜を破壊する役割を持つＤＮＡであるトリガーが入っているアルギン酸膜を作製し、ある条件を満たせばそのアルギン酸膜が内側から破壊されてトリガーが放出されるシステムを作る。 ②反応が連鎖できるように内部にトリガーが入っており、外側にリポソームが結合すれば割れるように設計されたリポソーム膜を作製する。 私たちは「内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト」と「外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト」の二つのサブプロジェクトを実行してこのシステムの完成を目指しました。

    </article>

       <article data-title="アルギン酸">

<h3 id="designsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3>

内側からアルギン酸膜を破壊するために私たちは以下のようなシステムをデザインしました。（Fig1の数字と下記の説明の説明は対応している） ①内部にアルギン酸を溶かすキレート剤（ＥＧＴＡ）と尿素とトリガー（アルギン酸膜外にあるリポソームを割ることができるもの）となるＤＮＡオリガミ/ＤＮＡストランドを入れたニッパム分子付きのリポソームを作製します。ニッパムとは３２度以下では水和していて親水性だが、３２度以上では収縮して疎水性になる。ニッパムがリポソームに修飾されると、３２度以下ではニッパム分子の水和により安定な状態になるが、３２度以上ではニッパム分子が疎水性になって不安定な状態になるので、３２度以上になった時にリポソームが割れることになる。 参考 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf ②温度を約３２度に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊されます。 ③リポソームが破壊されたことで内部のキレート剤がアルギン酸膜を破壊し、それと同時に尿素が希釈されることでＤＮＡがハイブリタイゼーションしてトリガーとなるＤＮＡオリガミが形成されます。 ④破壊されたアルギン酸膜からトリガーのＤＮＡオリガミが外に出ていきます。 このようなシステムの設計によって、好きな時に温度を３７度に上げればトリガーを放出することが可能になります。 Subproject breaking membrane of algin acid from inner side We designed the following system to break membrane of algin acid from inner side 1.We made chelate agent of dissolving algin acid (EGTA),urea and liposome containing nipam and enclosing DNA strand and DNA origami, which can be triggers of breaking liposome lying outer the membrane of algin acid. nipam is hydrophile in the state of less than 32℃. However, in the state of more than 32℃, nipam constrict and become hydrophoby. Liposome modified by nipam is stable in the state of less than 32℃ due to hydration of nipam molecular, though it is unstable in the state of more than 32℃ because of hydrophoby of nipam molecular. So liposome will be bloken when the temperature of liposome is more than 32℃. We consult following URL. http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf 2.When the temperature of liposome is more than 32℃, it will be break down. 3.When liposome is broken, chelating agent enclosed in liposome broke down membrane of algin acid and urea solution is diluted. After that, DNA is annealed and formed DNA origami. 4.From broken membrane of algin acid, DNA origami fall out. These system enable us to emit trigger on us own time when we increase heat at 37℃.

<img src="http://openwetware.org/images/8/80/Design-alginate-00.png" alt="example-tab2" border="0"> Fig1 内側からアルギン酸膜を破壊し、トリガーとなるDNAオリガミを放出するシステム

       </article>

       <article data-title="Outside">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3> <h4 id="designsubproject2">Outside班</h4> リポソームが割れるという事象は、以下のように表現できる。 リポソームを割ることに必要な活性化エネルギーδを超えるために、私たちは以下の二つを考えた。 <ur> <li>①膜を湾曲させるアプローチ</li> <li>②フラワーミセルによるアプローチ</li></ur> <h5>①膜を湾曲させるアプローチ</h5> リポソームを割るため、私たちは生物が膜を湾曲させるメカニズムに着目した。膜の湾曲、すなわち不安定化を最大限に利用することが出来れば、膜の崩壊につながると考えたからである。膜を湾曲させるメカニズムには、以下の三つが提案されている(Membrane-bending proteins: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19780639)。

 <Img Src=" http://openwetware.org/images/0/0f/Lipo1.png" Align="left"> (自分で図をかきます)

Aは、両親媒性基をもつ分子が細胞膜に挿入されることにより、膜が湾曲するというものである。脂質二重膜の内側の強い疎水性部分は、脂質両膜をくっつけて離さない性質をもっている。このため、両親媒性基が片方の膜内に入りこみ、その膜が広がると、もう片方の膜は、少ない表面積でも済むように、内側になるようつられて曲がる。 Bは、膜表面に付着した分子が固い足場となり、下の膜を変形したり、あらかじめ湾曲されていた膜を固定化(stabilize)するというものである。 Cは、片方の膜に脂質を群がらせることにより、脂質の量が両膜で不均等になることにより、膜が湾曲するというものである。 生体膜を湾曲させるタンパク質のほとんどは、A~Cのメカニズムを組み合わせて使っている。 また、近年、タンパク質同士が密集することで、膜が湾曲されるという考えも提唱されている(Membrane bending by protein-protein crowding). これは、膜結合タンパク質同士の衝突による、横方向の圧力により、膜が曲がるというものである。 以上から、膜を不安定にさせるためには、 <ur><li>・固い足場となる</li> <li>・足場の影響を最大にするため、表面積が大きい</li> <li>・衝突により大きな圧力が生じる</li> 構造が有効であると考えられる。 私たちは、固い足場となる分子を実現するために、DNAオリガミに着目した。DNAオリガミは任意の形に固い構造を作ることができるからである。そして、表面積の大きい構造として、平面構造を、 <Img Src="http://openwetware.org/images/f/f9/Lipo2.png" Align="left"> 衝突により横方向に最大の圧力が生ずるような構造として、長方形や三角形を考えた。 <Img Src="http://openwetware.org/images/3/38/Lipo3.png" Align="left"> 長方形はそれ自体で一つの足場として働き、三角形(球面をもっとも効率よく覆う図形)は沢山集合して一つの固い足場を作ればもっとも効率が良いと考えられる。 長方形オリガミの設計は以下の様である。 <Img Src="http://openwetware.org/images/0/03/Lipo4.png" Align="left">

<Img Src="http://openwetware.org/images/a/a7/Lipo5.png" Align="right">

DNAオリガミは、縦67.6nm(26らせん)、横127nm(374塩基)の、長方形である。AFMでの観察時に裏表の区別が付けられるよう、右上で縦10らせん、横161塩基の長方形を切り取った形とした。設計はcaDNAno2で行った。 <Img Src="http://openwetware.org/images/d/dd/Lipo6.png" Align="right">

さらに、膜が不安定になるよう、このオリガミの中心部分のステイプル141本を、コレステロール付きDNAと結合させ(両親媒性基をもたせ)、膜に突き刺すことが出来るようにした。 つまり、このコレステロール修飾DNAは、リポソームと足場をつなぐ役割をするだけでなく、膜に突き刺さり、膜を不安定化する両親媒性分子としても働く。 <h5>②フラワーミセルによるアプローチ</h5> リポソームを割るには、フラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るというものである。 <Img Src="http://openwetware.org/images/7/7c/Lipo7.png">

今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。

リポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドと、これに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているため、リポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。

<Img Src="http://openwetware.org/images/9/9f/Lipo8.png"> <img src="http://openwetware.org/images/e/ec/Kari-design-bz.jpg"> 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAがハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。 <Img Src=" http://openwetware.org/images/e/e7/Lipo9.png ">

リポソーム内部の溶液中にトリガーを入れておくことができるので、①・②を使って、外側からリポソームを破壊し連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。

       </article>

       <article data-title="B-Z">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4>

まずリポソームを割る方法としてフラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るとゆうものである。

今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。 リポソームはDOPCで作った通常のものとDOPC、DPPC、cholesterolの三種類を混ぜ、相分離を形成しているものの二種類を用いる。 これはリポソーム表面の状態の違いによる収率の違いを調査するためである。 これらのリポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドを加えて、表面にDNAを生やす。 そこに先程修飾したDNAに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているためリポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。

リポソーム内部の溶液中にトリガーストランドを入れておくことができるので、この系であれば連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。

このシステムで使用するDNAの配列はDNAdesignを使って設計しました。 プログラムのソースはこちら。ループの部分が40nt, 20nt,10ntのDNAを設計しました。 赤色の部分がリポソームから生えているコレステロール付きのDNAと相補になっています。青色の部分が相補的になっていてこれらがハイブリタイゼーションすることでリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れます。

コレステロール付きDNAの配列 CCAGAAGACG -コレステロール ループが40nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTGCGAACCACGGTTCCCAGCGTGACCTTCATGCTTAAGTTTCGTCTTCTGG ループが40ntのトリガーストランド AAACTTAAGCATGAAGGTCACGCTGGGAACCGTGGTTCGC ループが20nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTTTCATAACATGAGGCGCCGTCGTCTTCTGG ループが20ntのトリガーストランド ACGGCGCCTCATGTTATGAA ループが10nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTCTGTAACTAACGTCTTCTGG ループが10ntのトリガーストランド TTAGTTACAG

      </article>

   </section>

   <footer>
       <p>&copy; Copyright Biomod 2013 Team Sendai
               <a href="http://www.molbot.mech.tohoku.ac.jp/index.html">

<img src="http://openwetware.org/images/3/36/Murata-nomura-logo.png"

                                     width="180" height="50" alt="Molcular Robotics Lab" border="0" align="right">

</a>

       <p>E-MAIL:
           <a href="mailto:biomod.teamsendai.2012@gmail.com">biomod.teamsendai.2012@gmail.com
           </a>
       </p>
       <br>
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