Biomod/2013/Sendai/design: Difference between revisions

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<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</br>the project breaking liposome from outside</h3></br>
<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</br>the project breaking liposome from outside</h3></br>
<h4 id="designsubproject2">Outside班</h4></br>
<h4 id="designsubproject2">Outside班</h4></br>
<p>リポソームが割れるという事象は、以下のように表現できる。</br>The event breaking liposome means as following mathematical expression.</p>
<p>
 
 
リポソームが割れるという事象は、以下のように表現できる。</br>The event breaking liposome means as following mathematical expression.</br>
Calculation</br></br>
 
・Thought</br>
　Assume that a vesicle of large radius existing underwater changes to the plural vesicles of small radius (fig 1). The free energy of each sates F1: large radius, and F2: small radius, probably have following relationship (fig 2).
 In this case, the vesicle is basically small states because being a small radius is more stable, but there is the energy gap “δ” that must exceed to change the size of vesicle.
In this time we do not calculate δ, but calculate the free energy in each radius. From these energy and radius, we demand the relationship of them.</br>
 
・Setting</br>
　Surfactant molecules of the N0 units exist underwater, and N units participate in the formation of the vesicle. Assume that surface area of one molecule A=0.6 [nm^2] and the number of molecules to be included in one vesicle with n units. The volume of the water V=10^(-4) [m^3]. This time, we use DOPC (C44H84NO8P) so the molecular weight m=785 [g/mol]. The temperature of the system T=300[K], and Boltzmann’s constant and Planck's constant use the follows.</br>
k_B=1.38 × 10^(-23)  [(m^2 kg)/(s^2 K)]</br>
h=6.63 × 10^(-34)  [(m^2 kg)/s]</br></br>
 
・Calculation result</br>
　Free energy “F” of the vesicle is given as follows.</br>
F=F(N,A,n,r)
=-k_B T ln⁡Z
In this time,</br>
Z=  1/(N_0-N)!(pf)_bulk^(N_0-N)  1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n)</br>
(pf)_bulk=(h/√(2πmk_B T) )^(-3) V</br>
(pf)bulk is a partition function of the single discrete molecule underwater, and (pf)vesicle is a partition function of the vesicle.</br>
Therefore, free energy “F”,</br>
F=-k_B T ln⁡〖1/(N_0-N)!(pf)_bulk^(N_0-N)  1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n) 〗</br>
In this calculation, we assume that N, T, and V are constant,</br>
F=-k_B T ( α+ln⁡〖1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n)  ) 〗  </br>
α=constant </br>
α= 0 at the moment of N0 – N = 0, so simplify,</br>
F=-k_B T  ln⁡〖1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n)  〗</br>
We do not know the from of (pf)vesicle, so this time we assume,</br>
(pf)_bulk= (pf)_vesicle</br>
N/n=X means the number of the vesicle of the whole system. So we calculate free energy by using this,</br>
F(X)=-k_B T ( 1.62X ×10^2-ln⁡〖X! )〗</br>
Here, a vesicle which radius is 100μm changes to each 10 and 100 vesicles, calculate each free energy,</br>
F(1)=-k_B T ( 1.62×10^2 )</br>
F(10)=-k_B T ( 1.60×10^3)</br>
F(100)=-k_B T ( 1.56×10^4)</br>
From these results, we get the follow (fig 3).</br>
From fig 3, free energy is smaller when the radius of vesicle is small.</br></br>
 
・Consideration</br>
　When all molecules participate in the formation of the vesicle, the free energy becomes a one-tenth time when the number of vesicle increase 10 times. 
In addition, we think that the vesicle of the small radius is more stable.</br></br>
 
 
 
 
 
</p>
<br>
<br>
<br>
<br>

Revision as of 08:11, 28 August 2013

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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<a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013" class="whiteSendai" style="float:right;"><img src="http://openwetware.org/images/6/6e/Biomod-logo.jpg" 

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            <a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai"><h1 style="color:white;" ><b>Biomod<span>2013<br>&emsp; Team</span>Sendai</b></h1></a> 

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   <section id="tabs">
     <article data-title="Design">
           <h2>Design</h2>

<p> <h3>全体のプロジェクト</h3></br> 私たちは、制御された薬の放出系を行うために膜構造を破壊してその反応が連鎖していくシステムを構築する。そしてこのシステムの実現のためには以下の２つが必要である。</br> ①好きなタイミングで反応の連鎖を開始できるように、内部にリポソーム膜を破壊する役割を持つＤＮＡであるトリガーが入っているアルギン酸膜を作製し、ある条件を満たせばそのアルギン酸膜が内側から破壊されてトリガーが放出されるシステムを作る。</br> ②反応が連鎖できるように内部にトリガーが入っており、外側にリポソームが結合すれば割れるように設計されたリポソーム膜を作製する。</br> 私たちは「内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト」と「外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト」の二つのサブプロジェクトを実行してこのシステムの完成を目指しました。</br></br>


<!-- <a href="#designsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</a><br> <a href="#designsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </a><br> <a href="#designsubproject3">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">B-Z班</font> </a> --> 

    </article>






       <article data-title="アルギン酸">

<h3 id="designsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3></br>

内側からアルギン酸膜を破壊するために私たちは以下のようなシステムをデザインしました。（Fig1の数字と下記の説明の説明は対応している）</br> ①内部にアルギン酸を溶かすキレート剤（ＥＧＴＡ）と尿素とトリガー（アルギン酸膜外にあるリポソームを割ることができるもの）となるＤＮＡオリガミ/ＤＮＡストランドを入れたニッパム分子付きのリポソームを作製します。ニッパムとは３２度以下では水和していて親水性だが、３２度以上では収縮して疎水性になる。ニッパムがリポソームに修飾されると、３２度以下ではニッパム分子の水和により安定な状態になるが、３２度以上ではニッパム分子が疎水性になって不安定な状態になるので、３２度以上になった時にリポソームが割れることになる。</br> 参考</br> http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf</br> </br> ②温度を約３２度に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊されます。</br> ③リポソームが破壊されたことで内部のキレート剤がアルギン酸膜を破壊し、それと同時に尿素が希釈されることでＤＮＡがハイブリタイゼーションしてトリガーとなるＤＮＡオリガミが形成されます。</br> ④破壊されたアルギン酸膜からトリガーのＤＮＡオリガミが外に出ていきます。</br> このようなシステムの設計によって、好きな時に温度を３７度に上げればトリガーを放出することが可能になります。</br></br> Subproject breaking membrane of algin acid from inner side</br> We designed the following system to break membrane of algin acid from inner side</br> 1.We made chelate agent of dissolving algin acid (EGTA),urea and liposome containing nipam and enclosing DNA strand and DNA origami, which can be triggers of breaking liposome lying outer the membrane of algin acid. nipam is hydrophile in the state of less than 32℃. However, in the state of more than 32℃, nipam constrict and become hydrophoby. Liposome modified by nipam is stable in the state of less than 32℃ due to hydration of nipam molecular, though it is unstable in the state of more than 32℃ because of hydrophoby of nipam molecular. So liposome will be bloken when the temperature of liposome is more than 32℃. We consult following URL.</br> http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf</br> 2.When the temperature of liposome is more than 32℃, it will be break down.</br> 3.When liposome is broken, chelating agent enclosed in liposome broke down membrane of algin acid and urea solution is diluted. After that, DNA is annealed and formed DNA origami.</br> 4.From broken membrane of algin acid, DNA origami fall out.</br> These system enable us to emit trigger on us own time when we increase heat at 37℃.</br>


<img src="http://openwetware.org/images/5/5a/Alginate-design-01.png" alt="example-tab2" border="0"></br> Fig1 内側からアルギン酸膜を破壊し、トリガーとなるDNAオリガミを放出するシステム 

       </article>





       <article data-title="Outside">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</br>the project breaking liposome from outside</h3></br> <h4 id="designsubproject2">Outside班</h4></br> <p>


リポソームが割れるという事象は、以下のように表現できる。</br>The event breaking liposome means as following mathematical expression.</br> Calculation</br></br>

・Thought</br> 　Assume that a vesicle of large radius existing underwater changes to the plural vesicles of small radius (fig 1). The free energy of each sates F1: large radius, and F2: small radius, probably have following relationship (fig 2).
 In this case, the vesicle is basically small states because being a small radius is more stable, but there is the energy gap “δ” that must exceed to change the size of vesicle.
In this time we do not calculate δ, but calculate the free energy in each radius. From these energy and radius, we demand the relationship of them.</br>

・Setting</br> 　Surfactant molecules of the N0 units exist underwater, and N units participate in the formation of the vesicle. Assume that surface area of one molecule A=0.6 [nm^2] and the number of molecules to be included in one vesicle with n units. The volume of the water V=10^(-4) [m^3]. This time, we use DOPC (C44H84NO8P) so the molecular weight m=785 [g/mol]. The temperature of the system T=300[K], and Boltzmann’s constant and Planck's constant use the follows.</br> k_B=1.38 × 10^(-23) [(m^2 kg)/(s^2 K)]</br> h=6.63 × 10^(-34) [(m^2 kg)/s]</br></br>

・Calculation result</br> 　Free energy “F” of the vesicle is given as follows.</br> F=F(N,A,n,r) =-k_B T ln⁡Z In this time,</br> Z= 1/(N_0-N)!(pf)_bulk^(N_0-N) 1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n)</br> (pf)_bulk=(h/√(2πmk_B T) )^(-3) V</br> (pf)bulk is a partition function of the single discrete molecule underwater, and (pf)vesicle is a partition function of the vesicle.</br> Therefore, free energy “F”,</br> F=-k_B T ln⁡〖1/(N_0-N)!(pf)_bulk^(N_0-N) 1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n) 〗</br> In this calculation, we assume that N, T, and V are constant,</br> F=-k_B T ( α+ln⁡〖1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n) ) 〗 </br> α=constant </br> α= 0 at the moment of N0 – N = 0, so simplify,</br> F=-k_B T ln⁡〖1/(N/n)!(pf)_vesicle^(N/n) 〗</br> We do not know the from of (pf)vesicle, so this time we assume,</br> (pf)_bulk= (pf)_vesicle</br> N/n=X means the number of the vesicle of the whole system. So we calculate free energy by using this,</br> F(X)=-k_B T ( 1.62X ×10^2-ln⁡〖X! )〗</br> Here, a vesicle which radius is 100μm changes to each 10 and 100 vesicles, calculate each free energy,</br> F(1)=-k_B T ( 1.62×10^2 )</br> F(10)=-k_B T ( 1.60×10^3)</br> F(100)=-k_B T ( 1.56×10^4)</br> From these results, we get the follow (fig 3).</br> From fig 3, free energy is smaller when the radius of vesicle is small.</br></br>

・Consideration</br> 　When all molecules participate in the formation of the vesicle, the free energy becomes a one-tenth time when the number of vesicle increase 10 times. 
In addition, we think that the vesicle of the small radius is more stable.</br></br>



</p> <br> <br> <p>リポソームを割ることに必要な活性化エネルギーδを超えるために、私たちは以下の二つを考えた。</br>To exceed activation energy to break liposome, we thought following two approaches.<br><ur> <li>Ⅰ膜を湾曲させるアプローチ</br>Ⅰapproach inflecting membrane.</li> <li>Ⅱフラワーミセルによるアプローチ</br>Ⅱapproach using flower micelle.</li></ur></p> <br> <h5>Ⅰ膜を湾曲させるアプローチ</br>Ⅰapproach inflecting membrane.</h5><br> リポソームを割るため、私たちは生物が膜を湾曲させるメカニズムに着目した。膜の湾曲、すなわち不安定化を最大限に利用することが出来れば、膜の崩壊につながると考えたからである。膜を湾曲させるメカニズムには、以下の三つが提案されている(Membrane-bending proteins: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19780639)。<br> To break liposome, we focused attention on the mechanism by which life inflect membrane because we thought inflection of membrane, which means maximal use of destabilization, leads to breakup of membrane. As mechanism of inflicting membrane, following three ideas are proposed. (Membrane-bending proteins: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19780639)</br>

<br> 


<Img Src="http://openwetware.org/images/0/0f/Lipo1.png" Align="left"> (自分で図をかきます)


Aは、両親媒性基をもつ分子が細胞膜に挿入されることにより、膜が湾曲するというものである。脂質二重膜の内側の強い疎水性部分は、脂質両膜をくっつけて離さない性質をもっている。このため、両親媒性基が片方の膜内に入りこみ、その膜が広がると、もう片方の膜は、少ない表面積でも済むように、内側になるようつられて曲がる。 <br> Bは、膜表面に付着した分子が固い足場となり、下の膜を変形したり、あらかじめ湾曲されていた膜を固定化(stabilize)するというものである。<br> Cは、片方の膜に脂質を群がらせることにより、脂質の量が両膜で不均等になることにより、膜が湾曲するというものである。 <br> <br> <br> 生体膜を湾曲させるタンパク質のほとんどは、A~Cのメカニズムを組み合わせて使っている。<br> また、近年、タンパク質同士が密集することで、膜が湾曲されるという考えも提唱されている(Membrane bending by protein-protein crowding). これは、膜結合タンパク質同士の衝突による、横方向の圧力により、膜が曲がるというものである。 <br>

Plan A is the inflection method of membrane by intercalation of amphiphilic molecule to the cell membrane. Strong hydrophobic point in the lipid bilayer membrane bond lipin two membrane. So when amphipathicity group cut into one membrane and the membrane become dilated, the other membrane bend so that the other membrane keep smaller surface area.</br> Plan B is the one by stabilization of bended membrane. Attached molecules on the surface of membrane form firm scaffolding and change shape under membrane.</br> Plan C is the one using imbalance of the amount of lipid. Protein accumulate lipid to the one side.</br> Almost protein inflecting biological membrane mingle A-C mechanism.</br> Recent year, the membrane bending by protein-protein crowing is suggested. In this system, membrane-binding proteins collide each other and they are bended under crosswise pressure.</br>

<br> 以上から、膜を不安定にさせるためには、<br> <ur><li>・固い足場となる</li> <li>・足場の影響を最大にするため、表面積が大きい</li> <li>・衝突により大きな圧力が生じる</li> 構造が有効であると考えられる。 <br> As above, the efficient designs to destabilize membrane are</br> <ur><li>forming rigid scaffoldings</li> <li>extending surface area to maximize the influence of scaffoldings.</li> <li>putting great press by hitting</li>


<br> 私たちは、固い足場となる分子を実現するために、DNAオリガミに着目した。DNAオリガミは任意の形に固い構造を作ることができるからである。 そして、表面積の大きい構造として、平面構造を、 <br> To make molecules which form rigid scaffoldings, we took note of DNA origami, because DNA origami can form any structure and they are rigid. As a long-surface model, we designed following tabular structure(Fig 2). </br>


<Img Src="http://openwetware.org/images/f/f9/Lipo2.png" Align="left">


<br>


<br> 衝突により横方向に最大の圧力が生ずるような構造として、長方形や三角形を考えた。<br> We also designed rectangular structure or triangular structure as the ones putting maximum siding pressure(Fig 3).</br>


<Img Src="http://openwetware.org/images/6/63/Outsidefig3.png" Align="left"> <br>


長方形はそれ自体で一つの足場として働き、三角形(球面をもっとも効率よく覆う図形)は沢山集合して一つの固い足場を作ればもっとも効率が良いと考えられる。<br> <br> 長方形オリガミの設計は以下の様である。<br> Rectangular structure work as one scaffolding in itself . A number of triangular ones (most efficient diagram covering sphere) form one rigid scaffolding by gathering. This designs are considered to be most efficient.</br> The design of rectangular DNA origami is as bellow.(Fig 4)</br>



<Img Src="http://openwetware.org/images/6/6e/Outsidefig4.png" Align="left"> 

<Img Src="http://openwetware.org/images/a/a7/Lipo5.png" Align="right">



<br> DNAオリガミは、縦67.6nm(26らせん)、横127nm(374塩基)の、長方形である。AFMでの観察時に裏表の区別が付けられるよう、右上で縦10らせん、横161塩基の長方形を切り取った形とした。設計はcaDNAno2で行った。<br> We used rectangular origami 67.6nm(26helixes) by 127nm(374bases) . We made cutout 10 helixes by 161 bases in this origami so that we can discriminate one side between the other. Besides, we associated 141 staples at the core of the origami with DNA modified by cholesterol, so that they penetrate membrane. We've designed by caDNAno2.</br>


<Img Src="http://openwetware.org/images/c/c5/Outsidefig5.png" Align="right">



<br> さらに、膜が不安定になるよう、このオリガミの中心部分のステイプル141本を、コレステロール付きDNAと結合させ(両親媒性基をもたせ)、膜に突き刺すことが出来るようにした。<br> つまり、このコレステロール修飾DNAは、リポソームと足場をつなぐ役割をするだけでなく、膜に突き刺さり、膜を不安定化する両親媒性分子としても働く。<br> In other words, DNA modified by cholesterol penetrate membrane and work amphipathic molecule to destabilize membrane as well as play a role connecting liposome to scaffolding(Fig5).</br> <br>

<h5>Ⅱフラワーミセルによるアプローチ</br>Ⅱapproach using flower micelle.</h5><br> リポソームを割るには、フラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るというものである。<br> There is a "flower micelle method" to break liposome. In this method, we tightly attached rings of copolymer to micelle. The rings become deformed by the change of temperature and deflect micelle, breaking it.</br>


<Img Src="http://openwetware.org/images/b/b2/Flower1.png">



<br> 今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。<br> We tried breaking liposome by applying the basis of "flower micelle".</br>

<br>リポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドと、これに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているため、リポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。<br> We added liposome to single-strand DNA modified by cholesterol and complementary DNA to previous one. Both ends of this DNA strand is designed to bind complementary DNA. So complementary DNA forms loop on the surface of liposome.</br>


<Img Src="http://openwetware.org/images/a/aa/Flower2.png"> <img src="http://openwetware.org/images/0/03/Flower3.png">



<br> <br> 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAがハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。<br>

Next, we added complementary trigger DNA to the one which forms the loop.　complementary trigger DNA binds the Loop DNA in hybridization. DNA would like to keep straight, because DNA is designed less than persistence length. Deflected liposome will be broken down dew to the force generated by the strain.</br>



<Img Src="http://openwetware.org/images/3/3b/Flower4.png">



<br> <br> リポソーム内部の溶液中にトリガーを入れておくことができるので、Ⅰ・Ⅱを使って、外側からリポソームを破壊し連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。<br> We considered to be easy to break liposome from the outside and to cause chain reaction because using Ⅰand Ⅱmethods, we can stow trigger in the solution at inner liposome.</br>

<br> 

       </article>

       <article data-title="B-Z">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3><br> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4><br>

まずリポソームを割る方法としてフラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るとゆうものである。</br>

今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。</br> リポソームはDOPCで作った通常のものとDOPC、DPPC、cholesterolの三種類を混ぜ、相分離を形成しているものの二種類を用いる。</br> これはリポソーム表面の状態の違いによる収率の違いを調査するためである。</br> これらのリポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドを加えて、表面にDNAを生やす。</br> そこに先程修飾したDNAに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているためリポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。</br> 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。</br></br>

リポソーム内部の溶液中にトリガーストランドを入れておくことができるので、この系であれば連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。</br>


このシステムで使用するDNAの配列はDNAdesignを使って設計しました。<br> プログラムのソースはこちら。ループの部分が40nt, 20nt,10ntのDNAを設計しました。<br> 赤色の部分がリポソームから生えているコレステロール付きのDNAと相補になっています。青色の部分が相補的になっていてこれらがハイブリタイゼーションすることでリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れます。<br>

<font size="-2"> コレステロール付きDNAの配列<br> <font color="red">CCAGAAGACG</font> -コレステロール<br> ループが40nt<br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTT<font color="blue">GCGAACCACGGTTCCCAGCGTGACCTTCATGCTTAAGTTT</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font><br> ループが40ntのトリガーストランド<br> <font color="blue">AAACTTAAGCATGAAGGTCACGCTGGGAACCGTGGTTCGC</font><br> ループが20nt<br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTTTT<font color="blue">CATAACATGAGGCGCCGT</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font><br> ループが20ntのトリガーストランド<br> <font color="blue">ACGGCGCCTCATGTTATGAA</font><br> ループが10nt<br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTT<font color="blue">CTGTAACTAA</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font><br> ループが10ntのトリガーストランド<br> <font color="blue">TTAGTTACAG</font><br>

<img src="http://openwetware.org/images/e/ec/Kari-design-bz.jpg">

</font>


<!-- </p> --> 

      </article>

   </section>

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