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Cell Gateの構造

Cell Gateの全体像を紹介。下の図をさらにシンプルで現実に即したものにする感じで。(Membraneにコレステロールの脚のついた六角柱のGateが貫通して、さらにGateが断面図になっていて中のPorterが見えるような図で説明)。Gate, Porter, Membraneが何の役割をしているのかさらっと説明。

Gate

なぜ六角柱にしたのかとか、DNAオリガミである理由とかが言えたらいいと思うけど、あるのでしょうか…? ショーンの論文を参考にしましたと画像付きで説明。caDNAnoのデータは…載せる?

仮の文章↓ We decided to use the structure of the hexagonal tube.The reason is because We think there is a reference on the hexagonal structure of DNA origami(ショーンの論文を紹介), and can take advantage of that knowledge.Next, We made a simulation in order to examine the size of the structure.Must not the size that it is the tube through anything.It must be large enough to be passed through the desired product, however.We also have the aim of this GATE stab in the cell membrane, it can not sting in the cell membrane of normal hexagonal tube.However, We can create a tube with a different structure by exchanging some staple.We have designed a simple tube first,and I have to be attached anywhere in the structure to replace the staple .We can later add functionality to an existing structure using this method.We thought that to have an affinity for lipid membrane with the DNA that can be modified cholesterol on the side of the tube by this method.In addition, we have also designed DNA-like beard at the entrance of the tube.We expect the effect of electrostatically repel force with DNA which are not intended.Our tube is small,so we designed the tube to connect to each other and be long in order to easily confirmed using AFM. By replacing the staple, this structure is also removably.

Porter

どのような種類のPorterを、どのような理由でそこに配置したのかとか…?(入口のPorterはシミュレーションから長くなくてはならないとか…?)Selectorの配列を表示。
仮の文章↓
We named the single stranded DNA “Porter” which stand in line in the GATE and transport the target. Porter is designed to be more complementary sequence to the target molecule as going back from the entrance. These designs enable to move to the inner porter because of the stability of combination. This way makes it possible to move the target. We did a simulation to find the best length and space of the porter. The result of simulation, we have found that not more than a certain distance away from the gate is the target DNA was negatively charged by electrostatic force so that the gate can be in the DNA. The solution of this phenomenon, we have to make the first Porter have enough length to beyond the original length and bring the target into the tube. So we design the Porter to take a loop structure when bound to the target molecule. It was believed that the Porter would be able to go beyond the distance to the complementary sequences in the various parts of Porter, inaccessible electrostatically by target molecule is bound in a stepwise manner, pull the material into the Gate. In actual experiment, we compare the トーホールド and rope structure to use following sequence(配列載せる). And, this is for electrophoresis, so it’s the sequence to extract only the part related to the binding of the target. Actual Gate’s sequence integrate about 10bp spacer sequence to reduce the Coulomb force which affected by the wall when moving.

Membrane

どの脂質をどういう理由で選び、どのように配合したのかとか…
仮の文章↓
We use liposomes as a model of cell membrane. We prepared a preliminary step to that cell gate insert into the liposome. We designed a smaller tube and attempted to insert into liposomes using it. Similar to the cell gate, we stretched single-stranded DNA of 10 bases that can be modified cholesterol from the side of this tube. We attached cholesterol to the single-stranded DNA, and expected that these enter into the hydrophobic portion of the liposome. Then, it is likely to that the tube stick to the liposome. However, it is considered that the tube would be in a state of lying on the liposome. So, when we designed the tube, we made one side too much for the extra M13 deliberately. We expect that the electrostatic symmetry of the tube is broken by this, and the tube penetrate the membrane standing vertically by repulsion.











ここから下、昔の文章なので参考までに…

Porter

Tubeの中に一列に並び、チャネルの原動力となる一本鎖DNAの列をPorterと名付ける。Porterは入口から奥へ行くほどターゲット分子との相補的な配列が多くなるように設計する。こうすることで“意図的に”エネルギー勾配を作り出すことができ、物質を移動させることができるようになる。
Ideaで言ったように、物質の通り道となるチャネルの外壁はDNAオリガミで作るため、短い一本鎖DNAではDNAのカスケードの流れにターゲット分子を乗せることはできない。Reference: Simulation </br> また、かといってただ単純に一本鎖DNAを伸ばしただけでは、クーロン力の壁を越えられず、先端の相補的な配列にターゲット分子が結合するのみで、一本鎖DNAは伸びきったまま、Tubeの中に物質を取り込むことはできないだろう。(画像載せる)
そこでPorterがターゲット分子と結合した場合、ループ構造をとるように設計した。Porterの各所にある相補的な配列に、段階的にターゲット分子が結合することにより、物体を引き寄せ、Tubeの中に物質を引き入れることができるようになるだろう。(画像載せる)また捕集できる場所が多くなるため捕集率も向上すると考えられる。(画像載せる)
実験では以下の配列を用いて、トーホールドとループ構造の比較を行った。(配列載せる)
また、これは電気泳動用の、ターゲットとの結合に関係する部分だけを抜き出した配列である。実際のTubeに搭載する場合はこの配列の他に、根元から10bpほどスペーサー配列を組み込むことで、移動中に壁から受けるクーロン力の影響を減らしている。
実験では主に、Tubeの中にターゲットを引き込むことを主眼としているが、入口から入って行ったターゲットを最も出口に近いPorterまで移動させ出口から放出するには、最も出口に近いPorterとターゲットの関係をトーホールドにしておき、結合した状態でさらにターゲットに相補的配列を持つ一本鎖DNAを投入すればよいと考えられる。
計算上、Tubeから出ることよりも、入ることのほうが難しい。
( Inside the gate, a cascade of three single stranded DNAs is planted. We named the DNAs Selector1, Selector2, and Selector3 from the outside of the gate. In addition, another Selector, which is called Selector4, is in the liposome.
[In the gate] Selector1and 2 have complementary sequences to a target oligonucleotide here and there and consecutive adenine sequences in other portion. We made an attempt to capture a target distant from the gate with high specificity. So we lay out a long Selector1. By catching a target and making loops, it can shrink and go in the gate.
Selector3 is complementary to the target, but it is shorter than the target. When it binds to the target, the upper end of the target makes a toehold.
We designed the inner Selector has higher bonding energy. So once the outer-most ssDNA binds to a target, the target is passed to the inner-ones one by one.
[In liposome] Selector4 is perfectly complementary to the target. After the target reaches Selector3, Selector4 conveys the target into liposome.)

NameSequence(5' to 3')Tm(°C)
target* - ACTAGTGAGTGCAGCAGTCGTACCA
Selector1AAAAAAAAAAAAAAAAATGGTACAAAAAAAAGACTGAAAAAAAACTGCA30.6
Selector2AAAAAAAAAAATGGTACAAAAGCTGCA36.5
Selector3TGGTACGACTGCTGCA62.3
Selector4TGGTACGACTGCTGCACTCA68.0

*Red-orange and blue-green regions are complementary DNA sequences.
*Black region is added to differ the molecular weight of each sample(for distinguishing them during electrophoresis).

Experiment page

Tube

まず我々は円形断面のTubeを想定した。しかし、円形断面は力学的に見て強度が低い。そのためか、円形断面に関するDNAオリガミ構造体のデータも少なく、円形断面のTubeを作ることは難しそうであった。力学的に最も強度の高い構造は、三角形断面であるが、三角形断面は作成に必要な材料の数が多くなるなどの問題が挙げられる。また、三角形というある種特異的な断面を使用すると、目標物質の形状に関する汎用性が低下するおそれがある。断面はなるべく円に近いほうが良い。
そこで考えたのが六角形断面、ハニカム構造の断面を持つ六角柱型のTubeである。六角形は三角形を6つ並べた構造をしているため、比較的強度が高く、建築物の構造にも使われ、自然界では蜂の巣の中などにその形を見出すことが出来る。また、六角柱型のDNAオリガミ構造体に関する参考文献(ショーンの論文を紹介)もあり、その知見を利用することが出来る。よってTubeは六角柱で構成することにする。
ただの六角柱では細胞膜に刺さることはできない。そこで、筒の側面にコレステロールを修飾したDNAを生やし脂質膜と親和性を持たせる。さらにそのままでは、脂質の上に寝た状態でいることが安定になるといけないので、六角柱のDNAオリガミを作製する際、わざと片側にM13を余らせることにした。このことで対称性が崩れ、反発力によって、Tubeが立ったまま細胞膜を貫通することができる。 Gate should be able to transport the target with selector inside gate and go through cell membrane. To transport the target with selector, we decided to make hexagonal tube as gate. The reasons we adopted hexagonal tube as gate are that surfaces of hexagonal tube are suitable for being attached selector, high strength of honeycomb structure are easy to be observed. To go through cell membrane, we placed the staple attached lipid on center of gate.
We expect gate is introduced liposome simultaneously with creation of liposome. In addition, we attached edge of the gate to adenine staple like a "mustache" to make easy watching by AFM and interrupt other DNA approaching. We think because of our selector 1 is enough long, only target is transported into the gate.
In addition to this, we made the cholesterol hexagonal tube. The reason that designed this tube is coupling into a liposome film using a characteristic of the cholesterol like a lipid. (cf.Figure 2.3 )

Structure image

This is the hexagonal tube design by caDNAno using honeycomb structure.(動いていない画像のほうがいいと思う)

Structure image

We made 3shape’s hexagonal tube.
1: Mere hexagonal tube
2: Hexagonal tube with the adenine at the entrance
3: The cholesterol hexagonal tube


Experiment page





















Membrane

We use liposomes as a model of cell membrane. To insert cell-gate into the liposome, we stretched out ssDNA of 10 nt from the side of the hexagonal tube. Then, we extend the complementary ssDNA, and modified the cholesterol at the end of them. We choose the cholesterol because cholesterol is strongly hydrophobic. We expect that cholesterol penetrate into the hydrophobic portion of the liposome. We confirmed the tube modifying the cholesterol by electrophoresis. We use fluorescein to confirm that the tube insert into the liposome correctly. (細胞膜のモデルとして、リポソームを使用する。リポソームにセルゲートを刺さるようにするために、六角形筒の横から10塩基のシングルストランドDNAを伸ばした。さらに、相補的なシングルストランドDNAを伸ばして、それらの末端にコレステロール修飾を行った。コレステロールを修飾したのは、コレステロールが強い疎水性であるからである。コレステロールがリポソームの疎水性部分に入り込むことで、筒がリポソームに刺さりやすくなると考えた。コレステロール修飾は電気泳動で確かめた。筒がリポソームに刺さっているかを確かめる方法として、蛍光分子を利用する。)
Experiment page